Конкретные и точного обнаружения цитрусовых озеленение возбудителя Candidatus liberibacter spp. Использование обычных ПЦР на цитрусовые образцы тканей листа

Общая цель этой процедуры заключается в точном обнаружении возбудителя позеленения цитрусовых Candidatus liberibacter spp. в тканях листьев цитрусовых. Этот метод позволяет фермерам и исследователям цитрусовых быстро и точно определить наличие патогена, ответственного за позеленение цитрусовых.

Демонстрировать процедуру будет Ян Палмер, аспирант из моей лаборатории. Этот метод является эффективным, экономичным и адаптируемым для количественного анализа. Кроме того, она может быть выполнена с минимальным уровнем лабораторного опыта и оборудования.

Сначала с помощью чистых ножниц срезайте целый свежий лист с цитрусового дерева и положите его в чистый пластиковый пакет для бутербродов. Затем охладите ступку и пестиком, добавив небольшое количество жидкого азота. Далее с помощью ножниц отрежьте небольшие кусочки ткани листа, размером примерно в один квадратный сантиметр.

Положите кусочки листьев в ступку, чтобы сразу же заморозить их. Быстро приступайте к растиранию листовой ткани с помощью ступки, пока жидкий азот не испарится, и не останется мелкий зеленый порошок. Затем охладите металлический шпатель в жидком азоте в течение 10-15 секунд.

Затем с помощью холодного шпателя зачерпните измельченную ткань из раствора в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. С помощью пипетки объемом 1000 мл добавьте в образец 600 мл раствора лизиса ядер. Затем сделайте образец вихревым в течение одной-трех секунд.

Инкубируйте трубку при температуре 65 градусов Цельсия, на водяной бане в течение 15 минут. По окончании инкубационного периода с помощью пипетки объемом 10 мл добавьте 3 мл раствора РНК в ликат для удаления РНК. Затем перемешайте содержимое тюбика, перевернув его два-пять раз.

Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут в шкафу-инкубаторе. Через 15 минут добавьте к образцу 200 мл раствора для осаждения белка. Поворачивайте трубку на высокой скорости в течение 20 секунд.

Затем центрифугируйте образец при 13000G в течение трех минут. В процессе центрифугирования добавьте 600 мл изопропанола, поддерживаемого при комнатной температуре, в новую микроцентрифугу объемом 1,5 мл. После окончания центрифугирования осторожно извлеките надосадочную жидкость из пробирки центрифуги, в пробирку, содержащую изопропанол.

Выбросьте гранулы. Переверните трубку, чтобы ДНК была видна как нить. Затем центрифугируйте образец при температуре 13000G в течение минуты при комнатной температуре.

Сцедите надосадочную жидкость после центрифугирования. Затем добавьте в гранулу 600 мл 70% этанола. Переверните трубку несколько раз, чтобы промыть гранулы.

Центрифугируйте пробирку при 13000G в течение одной минуты. После того, как центрифугирование закончится, осторожно отсасывайте надосадочную жидкость. Затем переверните трубку с открытой крышкой на впитывающую бумагу, чтобы она высохла на воздухе в течение 15 минут.

После высыхания добавьте в гранулу 100 мл раствора для регидратации ДНК. Инкубируйте суспензию ДНК при температуре 65 градусов Цельсия на водяной бане в течение часа. Периодически постукивайте по тюбику во время смешивания.

Добавьте 1 мл очищенной воды в микрокювету. Считывайте воду как пустую на спектрофотометре. Затем добавьте 1 мл образца в микрокювету.

Поместите микрокювету на спектрофотометр и получите концентрацию ДНК. Проведите реакцию ПЦР путем добавления всех реагентов и 100 нанограммов геномной ДНК в ПЦР-пробирку объемом 50 мл. Смешайте реагенты, осторожно переворачивая пробирку, после чего проведите быстрое центрифугирование.

Поместите пробирку для ПЦР в термоамплификатор и запустите программу. Для приготовления агарозного геля весят 0,4 грамма порошка агарозы. Затем добавьте порошок агарозы в колбу Эрленмейера объемом 200 мл, доведя объем до 50 мл с буфером 1X TAE.

Разогрейте агарозную смесь в микроволновой печи на высокой мощности около 1,5 минут. Встряхивая каждые 30 секунд до полного растворения агарозы. Далее добавьте в жидкость 2,5 мл 10 мг на миллилитр бромида этидия.

Затем встряхните колбу, чтобы смешать бромид этидия, и быстро вылейте жидкий агарозный гель в ровную гелевую форму. Сразу же вставьте стандартную гелевую расческу на 12 зубьев. Дайте гелю остыть около 20 минут при комнатной температуре, а затем снимите гелевый гребень.

Теперь поместите затвердевший гель в установку для электрофореза, заполненную 1X буфером TAE. Загрузите общий амплифицированный образец ДНК и 5 мл ДНК позже в отдельные лунки на гель. Запустите блок электрофореза при постоянном напряжении 90 вольт в течение 35 минут.

Затем извлеките гель из установки для электрофореза. Далее поместите гель на УФ-трансиллюминатор. Сделайте фотографии узоров гелевых полос в трансиллюминаторе с яркостью 302 нанометра.

Для идентификации зеленеющей бактерии с помощью ПЦР-амплификации геномных ДНК, полученных как из инфицированных, так и из неинфицированных образцов, проводят электрофоресацию. В геле эти полосы, соответствующие 500 парам оснований, указывают на наличие специфического участка рибосомальной ДНК Las16S у бактерии CL asiaticas. Эти полосы, соответствующие 700 парам оснований, указывают на присутствие LAA2/LAJ5 и встраиваются в последовательность ДНК 16S рибосомального бета-оперона у бактерии.

Эти отдельные полосы на 400 парах оснований указывают на амплификацию только гена F-box цитрусовых, который относится к внутреннему контролю амплификации. Для того, чтобы наши результаты были достоверными, необходимо наличие этой полосы. Напротив, наличие только полосы на 400 парах оснований, но отсутствие других полос на 500 и 700 парах оснований свидетельствует о здоровой цитрусовой ткани.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за четыре часа, если она выполнена правильно. Эта процедура может быть адаптирована для обеспечения выполнения более количественных методов, таких как RTQPCR, для определения количества присутствующего патогена.