Потока на основе цитометрии проба для выявления соединений, которые нарушают Связывание лиганда дневно меченых КЭС хемокиновых 12 КЭС хемокиновых рецепторов 4
10 марта 2018 г.
Поток, описал сотовой привязку на основе цитометрии пробирного, который используется главным образом как инструмент скрининга для выявления соединений, которые тормозят привязки дневно обозначенные КЭС хемокиновых лигандом 12 (CXCL12) КЭС хемокиновых рецепторов 4 (CXCR4).
Общая цель клеточного анализа заключается в идентификации молекул, которые связываются с рецептором, связанным с G-белком. Они основаны на их способности конкурировать с флуоресцентно меченным лигандом за связывание с рецептором. Анализ связывания конкуренции может способствовать открытию рецепторов, сопряженных с G-белком.
Как мы продемонстрируем на примере этого протокола для хемокинового рецептора CXC4. Основное преимущество этого метода заключается в том, что для анализа рецептивного связывания используются живые клетки, а не подготовка памяти. И что исключается использование зондов для меток радиоактивности.
Хотя этот метод первоначально был разработан для изучения связывания с хемокиновым рецептором CXCR4, он также может быть разработан для других GPCR, для которых существуют флуоресцентно меченные лиганды. Для начала налейте 100 микролитров раствора в прозрачную 96 хорошо закругленную нижнюю пластину в соответствии с заранее определенной экспериментальной схемой. Добавьте 50 микролитров клеточной суспензии из резервуара с реагентом в 96-луночный планшет с помощью многоканальной пипетки.
Выдержите тарелку в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. После инкубации добавьте 50 микролитров флуоресцентно меченного 100 нанограммов на миллилитр CXCL12 из аналогичного резервуара с реагентами в лунки 96-луночной пластины. Выдерживать 30 минут при комнатной температуре в темноте.
Затем центрифугируйте 96-луночный планшет при 400-кратной гравитации в течение пяти минут при комнатной температуре. Удалите надосадочную жидкость из гранулированных клеток, перевернув пластину. Высушите пластину на салфетке.
Добавьте в лунки 200 микролитров свежего буфера SA из резервуара с реагентом с помощью многоканальной пипетки. Немедленно приступайте к центрифугированию планшета еще раз, в течение пяти минут при 400-кратной силе тяжести при комнатной температуре. Снова удалите надосадочную жидкость, перевернув пластину и затем высушив ее на салфетке.
Наконец, аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах 1% параформальдегида, растворенного в PBS. Этот шаг позволит закрепить клетки. Чтобы проанализировать образцы с помощью проточной цитометрии, запустите прибор и откройте соответствующее программное обеспечение.
Выберите параметры соты, которые будут визуализированы в формате точечного блока, такие как область прямого рассеяния, боковая область рассеяния, а в представлении гистограммы — канал обнаружения флюорограммы. Выберите один образец. Например, отрицательный контрольный образец для выполнения стробирования определенной однородной популяции клеток на основе параметров прямого и бокового рассеяния.
Адаптируйте настройки загрузки клеток в аппарат проточной цитометрии. Перед инъекцией выберите три смеси. Выберите автоматический впрыск 100 микролитров фиксированных клеток, и используйте скорость потока образца 1,5 микролитра в секунду.
Запустите пример, выбрав Получение данных. Теперь на экране появятся параметры прямого и бокового рассеяния для этого образца, а также обнаружение флюоро-4. Теперь выберите инструмент для программного шлюзования.
На основе визуализации графика прямого и бокового рассеяния можно заранее определить однородную и жизнеспособную популяцию клеток с помощью стробирования. Выберите для анализа 20 000 событий на выборку. Это означает, что для каждого образца в конечном итоге будут проанализированы 20 000 клеток, которые попадают в заранее определенные вентили
.Сбор данных будет продолжаться до тех пор, пока не будет достигнуто это количество событий. Начните спуск, выбрав сначала скважины для анализа. Затем выбирается прогон скважин.
Теперь устройство проточной цитометрии будет анализировать эти образцы один за другим, записывая среднюю интенсивность флуоресценции для каждого образца. Что соответствует среднему флуоресцентному сигналу от 20 000 клеток, попадающих в заданный вентиль. Наконец, выполните анализ данных, как описано в протоколе.
После предварительной инкубации клеток юрката с высокими концентрациями AMD3100, неустановленного и специфического антагониста CXCR4. Средняя интенсивность флуоресценции, отражающая связывание меченого CXCL12, почти полностью снижается до фоновых уровней. Это демонстрирует высокоспецифичное связывание CXCL12 с CXCR4, экспрессируемым на клетках юрката.
Соединения, которые не могут конкурировать с меченым CXCL12 за связывание с рецептором CXCR4, такие как антагонист CCR5 Маравирок, не будут влиять на среднюю интенсивность флуоресценции. Напротив, высокоактивные соединения будут делать это дозозависимым образом. После просмотра видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить конкурентный анализ рецептивного связывания с использованием живых клеток и проточной цитометрии.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод анализа клеточного связывания на основе проточной цитометрии, предназначенный для поиска соединений, ингибирующих связывание CXCL12 с CXCR4. В данном методе используются живые клетки для анализа связывания с рецептором, что позволяет избежать использования радиоактивных меток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Анализы клеточного связывания
- Рецепторы, сопряженные с G-белком
- Разработка лекарственных препаратов
Теоретические основы
- CXCL12 представляет собой хемокин, который связывается с CXCR4 — G-белоксопряженным рецептором.
- Поиск ингибиторов этого связывания может помочь в разработке лекарственных препаратов.
- Традиционные методы часто предполагают использование радиоактивных изотопов, чего данный анализ позволяет избежать.
- Использование живых клеток обеспечивает более точное воспроизведение биологических взаимодействий.
Цель исследования
- Разработать инструмент скрининга для идентификации соединений, ингибирующих связывание CXCL12 с CXCR4.
- Продемонстрировать преимущества использования живых клеток в анализах связывания.
- Оказать поддержку усилиям по поиску и разработке лекарственных средств, воздействующих на G-белоксопряженные рецепторы.
Используемые методы
- Проточная цитометрия для анализа клеточного связывания.
- Использование флуоресцентно-меченных лигандов для оценки конкуренции за связывание.
- Анализы на живых клетках для оценки рецепторных взаимодействий.
- Отказ от радиоактивного мечения в схеме эксперимента.
Основные результаты
- Данный анализ позволяет успешно идентифицировать соединения, ингибирующие связывание CXCL12.
- Анализ живых клеток предоставляет более релевантные данные по сравнению с традиционными методами.
- Метод эффективен для скрининга потенциальных кандидатов в лекарственные препараты.
- Результаты подтверждают возможность использования данного анализа в процессе разработки лекарственных средств.
Выводы
- Анализ на основе проточной цитометрии является ценным инструментом для идентификации ингибиторов CXCR4.
- Использование живых клеток повышает точность исследований связывания.
- Отказ от использования радиоактивных веществ упрощает процесс проведения эксперимента.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Этот метод анализа конкурентного связывания на основе проточной цитометрии позволяет биофармацевтическим группам выявлять малые молекулы, нарушающие взаимодействие CXCL12-CXCR4, которое является ключевой мишенью в разработках препаратов для лечения онкологических и воспалительных заболеваний. Благодаря использованию живых клеток и флуоресцентных лигандов, данный метод позволяет избежать применения радиоактивных веществ, обеспечивая при этом получение физиологически релевантных данных о связывании. Метод поддерживает валидацию мишени на ранних этапах и идентификацию перспективных соединений, предоставляя количественные, воспроизводимые результаты для приоритизации соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем измерения прямого влияния соединений на связывание рецептора с лигандом в нативном клеточном контексте.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональный показатель, который снижает риски использования CXCR4 в качестве мишени за счет механистического подтверждения активности соединения.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля препаратов путем выявления соединений с дозозависимыми профилями ингибирования, указывающими на взаимодействие с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные об ингибировании связывания по средней интенсивности флуоресценции, что делает возможным анализ зависимости «структура — активность».
- Практическая ценность: метод адаптируется к формату 96-луночного планшета, что повышает пропускную способность скрининговых кампаний при сохранении воспроизводимости анализа.
- Возможность повторного использования: создает стандартизированную платформу, применимую к другим GPCR при наличии флуоресцентных лигандов, что снижает затраты на повторную разработку метода.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: использование живых клеток Jurkat позволяет отразить физиологическую экспрессию рецепторов и динамику связывания, что повышает трансляционную значимость исследования.
- Практическая ценность: получение данных, совместимых с последующей доклинической оценкой, путем подтверждения специфического действия соединений на мишень.
- Снижение рисков: уменьшение количества ложноположительных результатов за счет дифференциации специфических ингибиторов CXCR4 и неспецифических соединений (например, Maraviroc не оказывает влияния).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ вписывается в континуум разработки лекарственных средств — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя данные о связывании, которые используются при переходе от хитов к лидерам. Он дополняет фенотипический скрининг, обеспечивая более глубокое понимание механизмов действия исследуемых соединений.
- Биология открытий: Поддерживает проверку гипотез путем количественной оценки вызванного соединением нарушения связывания CXCL12 с CXCR4 в живых клетках.
- Скрининг: Обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированных этапов инкубации, промывки и фиксации, совместимых с методами считывания проточной цитометрии.
- Аналитика: Предоставляет среднюю интенсивность флуоресценции в качестве количественного выходного показателя для сравнения силы действия и эффективности соединений при различных дозах.
- Трансляционные исследования: Использует релевантную заболеванию клеточную линию (Jurkat), экспрессирующую CXCR4, что связывает данные о связывании с потенциальным терапевтическим воздействием при раке и воспалении.
- Корпоративное повторное использование: Функционирует как модульная платформа связывания, применимая к различным мишеням GPCR, что максимизирует окупаемость инвестиций (ROI) в разработку анализа.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает уверенность в прогнозировании взаимодействия с мишенью, демонстрируя специфическое, вытесняемое связывание CXCL12 с CXCR4.
- Операционная ценность: обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированного обращения с клетками, времени инкубации и протоколов гейтирования при проточной цитометрии.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), позволяя на ранних этапах поиска отсеивать соединения, лишенные специфической активности в отношении мишени.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять продвижение разработок с учетом рисков путем выявления соединений с четким профилем дозозависимого ингибирования.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с проточной цитометрией, в том числе в области компенсации и стратегий гейтирования жизнеспособных популяций клеток.
- Зависимость от наличия проточных цитометров, способных детектировать флуоресцентные сигналы в соответствующем канале (например, FITC или эквиваленте).
- Необходима стандартизация подготовки клеток, разведения соединений и условий инкубации во всех сериях скрининга.
- Адаптация метода для других GPCR требует разработки или приобретения флуоресцентно меченных лигандов, специфичных для целевого рецептора.
- Практические ограничения включают продолжительность анализа (~90 минут плюс время анализа), а также необходимость оптимизации концентрации лиганда для обеспечения устойчивого соотношения сигнал/шум.
