Желчь соли индуцированной биопленки в кишечных патогенов: методы для идентификации и количественной оценки

Общей целью данного протокола формирования и оценки биопленки является определение способности кишечных бактериальных патогенов образовывать биопленку, особенно в условиях, имитирующих желудочно-кишечный транзит и воздействие желчных солей. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериального патогенеза, такие как способность кишечных патогенов выживать в суровых условиях содержания желчных солей в желудочно-кишечном тракте. Основное преимущество этих методов заключается в том, что объединенные результаты трех анализов поддерживают глубокую характеристику образования биопленки в ответ на воздействие желчных солей для каждого патогена.

Впервые у нас возникла идея комбинированных методов, учитывая необходимость полного количественного определения образования биопленки, вызванной желчными солями, у Shigella flexneri. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что некоторые аспекты анализа могут ограничивать воспроизводимость. Поэтому, пожалуйста, обратите внимание на критические шаги, чтобы обеспечить воспроизводимость.

Демонстрировать процедуры будут члены моей лаборатории, Кортни Ничерсон, научный сотрудник, и Алехандро Льянос, научный сотрудник по клиническим исследованиям. Во-первых, пометьте две пробирки объемом 1,5 миллилитров как TSB и TSB плюс BS. Затем добавьте один миллилитр TSB или TSB плюс BS в соответствующие пробирки. Затем инокулируйте в пробирки 20 микролитров ночной культуры в разведении один к 50.

Затем добавьте по 130 микролитров неинокулированной контрольной среды в каждую из трех лунок в стерильный, прозрачный, плоскодонный, обработанный культурой тканей, 96-луночный планшет. Это будет пустой контроль. Добавьте по 130 микролитров инокулированной культуры в каждую из трех лунок.

После добавления контрольной и инокулированной культуры в соответствующие лунки инкубируйте 96-луночный планшет в течение от четырех до 24 часов при температуре 37 градусов Цельсия статически. После завершения инкубации установите контрольную ячейку в пустое положение на считывателе планшетов. Далее отсасывайте питательную среду из каждой лунки.

Затем аккуратно промойте лунки один раз 200 микролитрами стерильного PBS. После промывки аспирируйте PBS, а затем переверните пластину для высыхания в течение примерно 20 минут. Очень важно обеспечить бережное удаление среды и бережную промывку, чтобы не повредить матрицу EPS.

Далее добавьте по 150 микролитров 0,5% кристаллической фиалки в каждую из экспериментальных и контрольных лунок. Затем выдержите тарелку в течение пяти минут при комнатной температуре. Через пять минут один раз промойте лунки 400 микролитрами дистиллированной воды.

Добавьте 200 микролитров дистиллированной воды, чтобы промыть лунки пять раз. После всех пяти стирок переверните пластину и дайте ей полностью высохнуть, защищенной от света. Для получения стабильных результатов важно, чтобы образцы были тщательно высушены, прежде чем продолжить.

После того как пластина полностью высохнет, используйте 200 микролитров 95% этанола для удаления пятен с лунок. Затем оставьте тарелку на шейкере на 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия, во избежание испарения. Через 30 минут запишите внешний диаметр 540 на считыватель пластин.

Для полуколичественного обнаружения ЭПС используйте многоканальную пипетку для переноса питательной среды на прозрачную 96-луночную пластину. Затем с помощью 200 микролитров фиксирующего реагента зафиксировать черную пластину в течение 15 минут при комнатной температуре. Теперь запишите показания наружного диаметра 600, установив ячейку управления в качестве заготовки для стандартизации.

Затем запишите показания питательной среды, пока приверженное население фиксируется. После завершения фиксации удалите реагент и выбросьте его вместе с опасными отходами. Затем используйте 200 микролитров стерильного PBS, чтобы дважды аккуратно промыть лунки.

После промывания аспирируйте PBS. Далее добавьте 150 микролитров по 25 микрограмм на миллилитр ConA-FITC. Выдерживайте тарелку при комнатной температуре в течение 15 минут.

После инкубации аккуратно промойте лунки 200 микролитрами PBS. Затем добавьте по 150 микролитров PBS в каждую лунку и зарегистрируйте флуоресценцию на уровне 488 нанометров. После приготовления свежих реагентов прогрейте ПБС, ПБС с глюкозой, ПБС с желчными солями, а ПБС с глюкозой и желчными солями до 27 градусов Цельсия.

Затем запишите значения наружного диаметра 600 с ночного биопленочного планшета на считыватель планшетов, установив контрольный колодец в пустое положение. Далее отсасывайте питательную среду с помощью вакуумной линии, не нарушая прилипшую популяцию на пластиковой поверхности. Дважды аккуратно промойте лунки 200 микролитрами стерильного PBS.

После промывки PBS добавьте в каждую из трех лунок по 130 микролитров предварительно подогретого PBS, PBS с глюкозой, PBS с желчными солями и PBS с желчными солями и глюкозой, затем инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут достаньте тарелку из инкубатора. Выведите надосадочную жидкость пипеткой в свежий стерильный планшет на 96 лунок.

Наконец, приготовьте от одного до 10 последовательных разведений надосадочной жидкости с PBS в 96-луночном планшете или в блоке разведения. Затем с помощью многоканальной пипетки перенесите пять микролитров каждого разведения на агаровые пластины LB. Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия на ночь.

На следующий день подсчитайте количество колоний. Столбчатая диаграмма получена для количественной оценки образования биопленки, зависящей от желчных солей, у кишечных патогенов. Это делается путем построения графика значений наружного диаметра 540 для отдельных штаммов в присутствии и отсутствии солей желчных кислот в среде.

На графике показано значительное увеличение биопленкообразования для большинства штаммов патогена, за исключением энтероагрегативной кишечной палочки. Затем ЭПС, образующийся при образовании биопленки, определяется путем определения количества ConA-FITC, удерживаемого ЭПС. Столбчатая диаграмма показывает значительно повышенное показание флуоресценции в присутствии желчных солей.

Это подтверждает выработку пенополистирола для патогена Shigella flexneri. При этом ConA-FITC-зависимое окрашивание матрицы EPS значительно высок при воздействии желчных солей. Это свидетельствует об образовании бактериальной биопленки, характеризующейся богатой полисахаридами матрицей EPS.

One X PBS и DAPI используются для демонстрации FITC-зависимой специфичности и наличия бактериальной ДНК соответственно. Наконец, подсчитывается количество колониеобразующих единиц для анализа зависимой от желчных солей дисперсии бактерий из биопленки. На графике видно, что бактерии легко диспергируются из биопленок в PBS и PBS с глюкозой.

Однако воздействие на бактерии солей желчных кислот резко подавляет их диспергирование из биопленок. Эти анализы были разработаны для захвата и количественного определения транзиторных вирулентных биопленок, образованных кишечными патогенами, в частности Shigella flexneri, в ответ на воздействие желчных солей в тонком кишечнике до инфицирования в толстой кишке. Изменения в анализах, такие как типы основных сред, состав используемых желчных солей и условия роста бактерий, могут потребовать корректировки для различных патогенов, в зависимости от места инфекции в желудочно-кишечном тракте.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять каждый из анализов, чтобы тщательно оценить образование биопленки у интересующего вас бактериального или мутантного штамма. Помните, что работа с патогенами и некоторыми растворами может быть крайне опасной. При проведении этих анализов всегда следует учитывать меры предосторожности, такие как соответствующие методы обращения и утилизации.

Кроме того, приготовление свежих сред желчных солей, надлежащий контроль и обеспечение экспериментальной воспроизводимости имеют жизненно важное значение для анализа данных и подтверждения фенотипа биопленки, вызванной желчными солями. Эти методы, которые являются уникальными и творческими высокопроизводительными приложениями традиционных методов, позволят провести надлежащую количественную оценку многогранного и динамичного процесса образования биопленки, вызванной желчными солями, у кишечных патогенов.