MPLEx протокол для мульти omic анализ образцов почвы

Этот метод используется в области протеомики, метаболомики и липидомики, помогая получить исчерпывающую информацию о молекулярных изменениях, происходящих в почвенных микробных сообществах из-за возмущений окружающей среды. Основное преимущество этого метода заключается в том, что получение нескольких аналитов из одного образца почвы повышает точность и аккуратность при одновременном сокращении времени и усилий на подготовку образцов. Для начала каждый 20-граммовый образец почвы взвесьте 10 граммов в две отдельные 50-миллилитровые пробирки, совместимые с метанолом/хлороформом.

Используйте пластиковые трубки, изготовленные из ПТФЭ, так как хлороформ выщелачивает большую часть пластика, загрязняя образцы. Добавьте примерно по 10 миллилитров промытой хлороформом нержавеющей стали и гранатовых шариков в каждую трубку. Затем, находясь на льду, добавьте в каждую пробирку по четыре миллилитра холодной сверхчистой воды, и перенесите образцы в ведре со льдом в вытяжной шкаф.

С помощью стеклянной серологической пипетки объемом 25 миллилитров быстро добавьте в пробирки 20 миллилитров ледяного хлороформа в соотношении два к одному. Закрутите крышки и перемешайте почвенную смесь в раствор. Хлороформ-метанол помогает разрушать клеточную стенку прокариот, а также инактивирует ферментативную активность.

Затем прикрепите трубки к 50-миллилитровым вихревым насадкам и по возможности горизонтально согнейте в течение 10 минут при температуре четыре градуса Цельсия в холодильнике. Затем поместите образцы в морозильную камеру с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия примерно на 15 минут, чтобы полностью охладить их. Затем, используя ультразвуковой зонд внутри вытяжного шкафа, произведите ультразвуковую обработку каждого образца шестимиллиметровым зондом с амплитудой 60% в течение 30 секунд на льду.

После обработки ультразвуком поместите образцы в морозильную камеру с температурой минус 80 градусов по Цельсию, так как обработка ультразвуком может выделять много тепла. После повторения этапов горизонтального вихряния, ультразвуковой обработки и замораживания центрифугируйте образцы при давлении в 4000 раз и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. На этом этапе образец будет разделен на верхний слой метаболитов, промежуточный слой белка и нижний липидный слой.

Поместите образцы на лед. Затем внутри вытяжного шкафа с помощью 10-миллилитровой стеклянной серологической пипетки перенесите верхние слои метаболитов из двух 50-миллилитровых пробирок в один большой стеклянный флакон. Теперь слегка наклоните 50-миллилитровую трубку, чтобы освободить промежуточный слой белка так, чтобы он свободно плавал на нижнем липидном слое.

Затем, используя чистый лабораторный шпатель из нержавеющей стали с плоской головкой, осторожно зачерпните оба белковых прослойки и поместите их вместе в одну новую 50-миллилитровую пробирку. С помощью стеклянной серологической пипетки объемом 25 миллилитров перенесите нижние липидные слои в один большой стеклянный флакон. Добавьте 20 миллилитров ледяного метанола в две пробирки с мусором и в одну пробирку с белковой прослойкой.

На короткое время сделайте трубки вихревыми и центрифугируйте гранулы мусора и промежуточный слой белка при давлении в 4000 раз и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем сцедите метанол в контейнер для опасных отходов внутри вытяжного шкафа. Заморозьте гранулы белка и мусора в жидком азоте и высушите их в лиофилизаторе около двух часов.

Добавьте 20 миллилитров буфера для солюбилизации белка в 50-миллимолярном трис-буфере, pH 8,0, в каждую из гранул мусора и 10 миллилитров в пробирку для промежуточного слоя белка. В вытяжном шкафу зондом обрабатывайте образцы ультразвуком с амплитудой 20% в течение 30 секунд, чтобы привести их в раствор. Сделайте образцы вихревыми в течение двух минут.

Затем поместите образец промежуточного слоя белка в вращатель лабораторной пробирки при температуре 50 градусов Цельсия на 30 минут для растворения белка. Горизонтально окуните образцы мусора в течение еще 10 минут, чтобы лизировать все оставшиеся неповрежденные клетки. Затем чередуйте образцы с промежуточными слоями белка в течение оставшихся 20 минут.

Центрифугируйте все образцы при 4500-кратном течении силы тяжести при комнатной температуре в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость из каждой пробирки в две пробирки по 50 миллилитров. Добавьте 10 миллилитров солюбилизационного буфера в белковую прослойную гранулу. Затем обработайте ультразвуком и закрутите гранулу обратно в раствор.

После центрифугирования равномерно соедините надосадочную жидкость в двух 50-миллилитровых пробирках с надосадочной жидкостью для гранул мусора и центрифугируйте пробирки в ведре с фиксированным углом наклона при давлении в 8 000 раз сильнее силы тяжести и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, чтобы удалить любой оставшийся мусор. Разделите надосадочную жидкость на две пробирки по 50 миллилитров. Затем с помощью стеклянной серологической пипетки объемом 10 миллилитров добавьте по 7,5 миллилитров ТСА в каждую пробирку.

Переведите образцы в раствор. Затем поместите образцы в морозильную камеру с отрицательным температурой 20 градусов Цельсия на срок от двух часов до ночи. Чтобы гранулировать осажденный белок, центрифугируйте образец при давлении в 4 500 раз сильнее и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут и сцеживайте надосадочную жидкость в отходы.

Добавьте 10 миллилитров 100% ледяного ацетона в каждую белковую гранулу. Сделайте трубки вихревыми, и соедините как шарики в одну трубку. Центрифугуйте, а затем сцедите ацетон.

Используя меньший объем ацетона, промойте гранулу дважды, и переложите суспензию в 1,5 или двухмиллилитровую трубку для окончательного отжима. Сцедите надосадочную жидкость в отходы и дайте грануле высохнуть в перевернутом виде на бумажной салфетке в вытяжном шкафу в течение примерно 20 минут. В зависимости от размера гранулы добавьте от 100 до 200 микролитров буфера для солюбилизации белка.

Обработайте ультразвуком и превратите гранулу в раствор. Учтите, что образец может быть вязким из-за выпадающих вместе с белком гуминовых веществ, которые будут удалены при последующем центрифугировании. Наконец, встряхните образец в инкубаторе или шейкере при 300 об/мин и 40 градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы растворить белок в раствор, прежде чем приступить к расщеплению белка или мгновенной заморозке для будущей обработки.

С использованием протокола MPLEx, продемонстрированного в этом видео, 3 376 пептидов, 105 липидов и 102 полярных метаболита были экстрагированы из родной почвы прерий Канзаса, и экстракция белков по протоколу сравнивается с наборами для экстракции белков и экстракцией SDS с использованием обратнофазных ЖХ-МС/МС. При первоначальном сравнении трех реплик коммерческого набора для экстракции белка и методов SDS только 12% пептидов перекрывались между двумя методами, что свидетельствует о сложности микробного сообщества и различных эффектах экстракции. При сравнении MPLEx с коммерческим набором для экстракции белка и экстрактами SDS, около 38% пептидов, наблюдаемых с использованием метода MPLEx, также были обнаружены при использовании SDS и/или экстракции из коммерческого набора.

Учитывая количество видов в почвенном бактериальном сообществе Канзаса и его метагеноме, совпадение идентификаций пептидов является разумным. Как показано здесь, широкая применимость подхода MPLEx была ранее оценена с использованием архея S.acidocaldarius, консорциума уницианобактерий, ткани коры головного мозга мыши, человеческой мочи и листьев A.thaliana. Во всех случаях количество белков, наблюдаемых с помощью метода MPLEx, было аналогично таковому для контрольной группы, что указывает на его полезность для многих различных типов образцов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как получить белки, метаболиты и липиды из одного образца почвы. При попытке выполнить эту процедуру важно быть гибким, так как все типы почв разные. Например, размер белковой прослойки будет варьироваться, в зависимости от биомассы почвы и гуминовых веществ, присутствующих в почве.

Не забывайте, что работа с хлороформом может быть чрезвычайно опасной, и при попытке этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в вытяжном шкафу.