С помощью dUTP трансферазы терминал-опосредованной Ник конце маркировки (TUNEL) и Caspase 3/7 Assays для измерения эпидермальный клеточной гибели лягушек с Chytridiomycosis

Общей целью данного эксперимента является наблюдение за влиянием грибкового возбудителя амфибий Batrachochytrium dendrobatidis на апоптоз и гибель клеток в эпидермальной ткани лягушек. Этот метод может помочь нам понять болезни диких животных, например, вызывает ли инфекция гибель клеток или, наоборот, существуют ли иммунные механизмы против инфекции. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она может быть выполнена на небольших образцах биопсии тканей, так что маленькие особи могут быть повторно взяты на протяжении всей инфекции.

Чтобы начать эту процедуру, подготовьте гидрофильные стеклянные стекла с образцом ткани, как указано в текстовом протоколе. Чтобы депарафинизировать срезы ткани, промойте предметные стекла трижды ксилолом в течение пяти минут каждый в банке с коплином. Далее промойте горки со 100% этанолом два раза по пять минут каждый.

После этого промойте горки с 95% этанолом и 70% этанолом по три минуты каждая. Затем промойте слайды один раз с помощью PBS в течение пяти минут. Для подготовки экспериментальных и отрицательных контрольных стекол предварительно обработайте ткань, добавив свежеразведенную протеиназу К непосредственно на предметные стекла.

Выдержите горки в течение 10 минут при комнатной температуре. Затем промойте слайды в PBS два раза по две минуты каждый. Для приготовления предметных стекол с положительным контролем предварительно обработайте ткань буфером DN, а затем инкубируйте стекла при комнатной температуре в течение пяти минут.

После этого растворите DNазу one в DN-буфере до конечной концентрации 0,1 микрограмма на миллилитр. Добавьте приготовленный раствор DNазы на предметные стекла. Инкубируйте предметные стекла в течение 15 минут при комнатной температуре.

Затем промойте предметные стекла дистиллированной водой в банке с коплином пять раз по три минуты каждая. Угасите реакцию в 3%-ной перекиси водорода в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее промойте слайды в PBS два раза по две минуты каждый.

Затем добавьте равновесный буфер в ткань на предметных стеклах. Выдерживать в течение 10 секунд при комнатной температуре. Затем сотрите лишнюю жидкость вокруг участка ткани.

Разведите терминальный фермент дезоксинуклеотидилтрансферазу в реакционном буфере. Затем добавьте его в ткани на экспериментальном и положительном контрольных предметных стеклах. Выдерживать во влажной камере в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого поместите предметные стекла в банку с коплином, содержащую рабочую концентрацию стопорного буфера. Помешивайте в течение 15 секунд, а затем инкубируйте предметные стекла при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем промойте предметные стекла PBS три раза по одной минуте каждый раз и стряхните лишнюю жидкость.

Далее добавьте конъюгат антидигоксигенин, предварительно подогретый до комнатной температуры, непосредственно на ткань. Выдержите предметные стекла в течение 30 минут при комнатной температуре во увлажненной темной камере. После завершения инкубации промойте предметные стекла PBS четыре раза по две минуты каждый.

Стряхните лишнюю жидкость. Затем добавьте монтажный материал на слайды. Добавьте 15 микролитров раствора DAPI в монтажную среду на предметных стеклах.

Покройте каждую горку крышкой и запечатайте лаком для ногтей. Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте. Используя флуоресцентный микроскоп, наблюдайте за предметными стеклами сразу после завершения процесса стояния.

Делайте фотографии 400 раз через случайные промежутки времени вдоль каждого участка кожи. Подсчитайте синие клетки, окрашенные DAPI, чтобы убедиться, что видно не менее 100 клеток на участке кожи каждого животного. Затем подсчитайте количество TUNEL-положительных клеток, которые выглядят как красные одиночные клетки с четкими краями.

Для начала используйте микроскоп с перевернутым светом 40 раз, чтобы сфотографировать каждый из пальцев ноги лягушки. Нарисуйте линии по краю зажима для пальцев ног и используйте программное обеспечение для обработки изображений, чтобы оценить площадь внутри формы. Чтобы оценить площадь поверхности трехмерного образца кожи, умножьте расчетную площадь на число пи.

Чтобы извлечь белки из замороженного образца лягушачьего пальца, поместите образец в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра с завинчивающейся крышкой, содержащую 100 микролитров буфера для образца и две бусины из нержавеющей стали. Используйте взбиватель для бусин на максимальной скорости для лизирования клеток. После этого поместите трубку на лед на три минуты.

Затем центрифугируйте пробирку для сбора надосадочной жидкости. Для проведения анализа каспазы 3/7 в 384-луночном планшете добавьте 10 микролитров буфера для образца в виде заготовки и 10 микролитров экстракта белка в трех экземплярах. Затем пипеткой нанесите 10 микролитров коммерчески доступного реагента каспазы 3/7 в белковый экстракт и пустые лунки.

Затем осторожно встряхните пластину в течение 15 секунд, чтобы смешать два реагента. Выдерживать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут. Наконец, используйте люминесцентный считыватель пластин для измерения люминесценции образца.

В этом исследовании инфицированные животные демонстрируют значительно больше TUNEL-положительных клеток по сравнению с контрольными животными, о чем свидетельствуют клетки, окрашенные в красный или розовый цвет. У контрольных животных TUNEL-положительных клеток мало, и они не концентрируются в эпидермисе. У инфицированных животных TUNEL-положительные клетки чаще встречаются в эпидермисе.

TUNEL-положительные клетки более сконцентрированы в местах инфицированных клеток и непосредственно примыкают к ним. Кроме того, более широко распространены TUNEL-положительные клетки над эпидермисом и в эпидермальных слоях, которые находятся глубже, чем там, где находился грибковый патоген. У инфицированных животных больше TUNEL-положительных клеток во всех трех типах кожи, особенно высокий уровень в коже бедер и вентера.

В анализе на каспазы интенсивность инфекции положительно коррелирует с активностью каспазы 3/7. Кроме того, активность каспазы 3/7 у инфицированных и неинфицированных животных варьировалась с течением времени. Активность каспазы 3/7 снизилась в течение первых нескольких недель после инокуляции, а затем увеличилась к концу седьмой недели у инфицированных животных.

Активность каспазы 3/7 оставалась постоянной у неинфицированных людей. Во время проведения процедуры анализа TUNEL важно прочитать предметные стекла в тот же день, что и анализ, чтобы избежать потери чувствительности и хранить предметные стекла в прохладном темном месте для защиты красителей. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как обнаружить апоптоз и гибель клеток с помощью двух различных методов обнаружения в небольших образцах тканей, таких как кожа амфибий.