Microdissection первичной почечной ткани сегментов и интеграция с технологией Роман эшафот свободной конструкции

Общая цель этой процедуры микроскопического препарирования заключается в выделении дискретных сегментов живой почечной ткани с неповрежденной почечной архитектурой для применения в тканевой инженерии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области тканевой инженерии, такие как можно ли стерильно собрать целые сегменты изолированной ткани первичного органа и сохранить их живыми в культуре? Основное преимущество этой методики заключается в том, что сегменты содержат неповрежденную почечную архитектуру, в отличие от использования клеточных линий для воссоздания сложного органа с более чем 26 различными типами клеток.

Применение этого метода распространяется на терапию терминальной стадии почечной недостаточности, поскольку эти конструкции улучшают фильтрацию и могут помочь пациентам избежать диализа. Во время операции надевайте надлежащее хирургическое снаряжение, включая маску и шапочку, чтобы свести к минимуму риск заражения. Точно так же прилагайте все усилия для поддержания стерильности на протяжении всего времени.

Начните подготовку с драпировки операционного стола. Далее откройте пачку автоклавных инструментов на стерильные портьеры. Они должны включать в себя три небольших гемостатика, тонкие щипцы с зубьями, тонкие щипцы без зубов и прямые ножницы для радужной оболочки.

Накройте центр операционного стола второй нефенестрированной хирургической простыней. Перед обустройством операционной приготовьте 50 миллилитров обогащенного антибиотиком DBPS и аликвоту пять миллилитров в 15-миллилитровую пробирку. Теперь примите обезболивание восьми-12-недельной мыши C57 black six и периодически контролируйте уровень анестезии, оценивая ее педальный рефлекс с помощью твердого пощипывания пальцев ног.

Затем используйте крем для удаления волос, чтобы удалить все волосы в области брюшной части туловища, и смойте крем и волосы дистиллированной водой. Затем перенесите мышь на операционный стол и положите ее на спину под неостекленную простыню. Теперь вырежьте двухсантиметровое квадратное остекление в драпировке над брюшком мыши.

Затем скрабатывайте открытые участки кожи повидон-йодом, а затем 70% этанолом три раза, чтобы стерилизовать кожу и завершить подготовку к операции. Начните операцию с использования тонких щипцов с зубами и ножницами для радужной оболочки. Сделайте разрез кожи в три-четыре сантиметра параллельно средней линии в полусантиметре левее средней линии.

Далее захватите брюшину с помощью тонких щипцов без зубов и надрежьте ножницами по радужной оболочке глаза, чтобы войти в брюшную полость. Затем нанесите гемостатики на верхний и нижний боковые края кожи и брюшины, чтобы создать боковое напряжение и усилить воздействие. Теперь аккуратно переместите содержимое кишечника вправо от брюшной полости, чтобы обнажить левую почку.

Затем аккуратно наложите вытяжение на почку, чтобы приподнять ее из брюшной полости. Теперь поместите кровоостанавливающее средство поперек ворот почки и с помощью ножниц радужной оболочки пересеките мочеточник и почечные сосуды. Затем переложите почку в трубку с 1%-ным пен-стрептококком ДБПС на лед.

Отнесите эту пробирку в стерильный культуральный колпак для обработки. Там переложите почку в 60-миллиметровую чашку Петри и дважды промойте ее свежими пятью миллилитрами DPBS, содержащими кальций и магний. После второго промывания суспензируйте почку в свежих пяти миллилитрах ДАПС в новую 60-миллиметровую посуду.

Затем приготовьте дополнительную чашку Петри, содержащую всего пять миллилитров DBPS, для последующего использования. Продолжайте использовать стерильную технику, включая стерильные перчатки, хирургическую маску и начес, чтобы свести к минимуму риск заражения. Затем задрапируйте область сцены и область вокруг стереомикроскопа.

Затем поместите пластиковые листы клея на ручки фокусировки микроскопа и распылите на них 70% этанола. Затем включите двойной осветитель на гусиной шее, чтобы осветить сцену. Теперь перейдем к стерильным простыням, откройте упаковку стерилизованных инструментов, содержащих тонкие щипцы без зубов, рукоятку скальпеля, лезвие скальпеля номер 15, два прямых гемостатика и две иглы с полым отверстием 30,5 калибра.

Поместите лезвие No 15 на рукоятку скальпеля и прикрепите по одному гемостату к каждой ступице адаптера иглы для создания инструментов для рассечения иглы. Теперь перенесите две чашки, одну с почкой в DPBS, а другую только с DPBS, в область микроскопа. Снимите крышку с чашкой для почек и сфокусируйте микроскоп на передней или задней поверхности почки с увеличением от 3,2 до 4 раз.

Затем с помощью недоминантной руки используйте тонкие щипцы без зубов, чтобы проколоть и прижать почку к чашке на нижнем и верхнем полюсах почки. Затем доминирующей рукой с помощью лезвия под номером 15 удалите полупрозрачный волокнистый капсульный слой с открытой поверхности. Сбрейте самые поверхностные 0,5 миллиметра с открытой поверхности поверхности почки, чтобы удалить остатки капсулы.

Продолжайте, используя лезвие под номером 15, рассеките перевернутую пирамиду ткани из декапсулированной области, которая составляет примерно два квадратных миллиметра. Затем переложите ткань в чистую посуду с ДБПС и выбросьте оставшуюся часть почки. Теперь сосредоточьтесь на рассеченной ткани и уменьшите увеличение до 1,5-2,0X.

Используя два игольчатых инструмента для гемостата в качестве режущих инструментов, разрежьте фрагмент ткани на все более мелкие кусочки, пока сегменты ткани не станут размером с кончики иглы или меньше. Должно быть изготовлено около 50 сегментов. Это критически важная часть процедуры.

Каждый сегмент должен быть точно равен диаметру кончика иглы 30-1/2 калибра, чтобы избежать больших сегментов, которые могут препятствовать диффузии. Верните ткань в колпак для культивирования тканей и удалите DPBS с помощью микропипетки P1000. Затем добавьте обратно пять миллиметров DMEM, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пен-стрептококком.

Затем немедленно культивируйте ткань или имплантируйте ее в клеточные конструкции. Жизнеспособность интактных почечных сегментов, полученных в результате описанной процедуры, изучали в течение трех дней в культуре с использованием анализа жизнеспособности. Зеленый флуоресцентный кальций AM присутствует с внутриклеточной эстеразной активностью, свидетельствующей о живых клетках.

Красный флуоресцентный гомодимер этидия-1 наблюдается с потерей целостности плазматической мембраны. Когда почечные сегменты были встроены в эндотелиальные фибробласты, свободные от каркаса, к третьему дню они были объединены с клеточными конструкциями для формирования интактных структур. Конструкты сохраняли свою преваскулярную эндотелиальную сеть, о чем свидетельствует мечение фактором фон Виллебранда.

Эпителиальные клетки почек можно увидеть зеленым цветом, помеченным цитокертаином-18. Чтобы проверить функциональность почек in vitro, конструкции инкубировали с меченым FITC альбумином. В то время как остаточный альбумин был обнаружен вдали от сегментов встроенной почечной ткани, в эпителиальных клетках почечных канальцев также были горячие точки.

Эти горячие точки представляют собой альбумин, который проходит внутрипросветно, что, как полагают, представляет собой обратный захват альбумина в клеточной конструкции почечного сегмента. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделить почечные сегменты из мышиных почек для применения в тканевой инженерии. После освоения эта процедура может быть выполнена за один-1-1/2 часа.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, включая посев клеточных конструкций, чтобы ответить на другие вопросы, касающиеся изготовления и характеристики почечных конструкций. Не забывайте, что работа с хирургическими инструментами и баллонами с кислородом под давлением может быть чрезвычайно опасной. Будьте осторожны при работе с острыми предметами и не забудьте закрепить кислородные баллоны на лабораторном столе.