Методы доставки двуцепочечной РНК Оральный побудить РНК-интерференции в флоэма и членистохоботные насекомых, растений sap питание

Общая цель этих процедур – продемонстрировать естественный метод перорального родоразрешения. Для ген-специфичных дцРНК индуцировать РНК-интерференцию in vivo и насекомых-вредителей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как доставлять биомолекулы внутрь насекомых, выяснить эффект молекулярных биопестицидов на основе РНК-интерференции и контролировать насекомых в окружающей среде.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что доставка через нуклеиновую кислоту может быть применена к питанию соком растений, а также к жевательным насекомым. Тем не менее, методы здесь демонстрируют доставку двухцепочечной РНК к вредителям-полужесткокрылым, таким как коричневый мраморный клоп, клоп-арлекин и азиатская цитрусовая псиллида. Их можно применять и к другим насекомым.

Чтобы начать протокол, выберите коричневого мраморного клопа 4-го возраста или нимф BMSB, вылупившихся из яйцевой массы, и морите их голодом в течение 24 часов до кормления дцРНК. Затем выберите стройную, сертифицированную органическую стручковую фасоль и промойте ее 0,2% раствором гипохлорита натрия в течение пяти минут. Затем проведите три промывки H2O двойной дистилляцией и дайте бобам высохнуть на воздухе.

Как только они высохнут, обрежьте стручковую фасоль с конца чашечки до общей длины 7,5 сантиметров с помощью чистого лезвия бритвы. Погрузите промытую и обрезанную стручковую фасоль в двухмиллилитровую микроцентрифугу без крышки, содержащую 300 микролитров контрольного раствора. Разбавляйте in vitro синтезированные lac Z, JHAMT или VGDSRNAs путем разбавления 5 микрограммов, или 20 микрограммов, и 300 микролитров РНК, воды, свободной от ДНК, чтобы получить конечные концентрации 0,017 микрограмма на микролитр или 0,067 микрограмма на микролитр соответственно.

Погрузите промытую и обрезанную стручковую фасоль в двухмиллилитровую микроцентрифугу без крышки, содержащую 300 микролитров раствора дцРНК. Оберните и запечатайте края пробирок микроцентрифуги, заключая в них погруженные бобы, чтобы предотвратить испарение раствора дцРНК и предотвратить попадание животных в микроцентрифужную пробирку. Поместите пробирки вертикально при комнатной температуре на три часа, чтобы раствор дцРНК мог проникнуть в стручковую фасоль за счет капиллярного действия.

Поместите пробирки в чистые полипропиленовые сосуды для культивирования и поместите в них 3 голодающие нимфы 4-го возраста BMSB. Обработайте трех насекомых на один сосуд для культивирования. Каждый из них содержит три стручковые фасоли с зеленым пищевым красителем, или раствором дцРНК.

Поддерживайте насекомых при температуре 25 градусов Цельсия и относительной влажности 72%, при температуре 16L, 8D фотопериод в инкубаторе. Позвольте насекомым питаться стручковой фасолью, погруженной и поглощенной дцРНК, в течение пяти дней, и пополняйте их свежим рационом обработанной дцРНК стручковой фасоли через три дня. Выберите растения или рассаду и не поливайте их за два-три дня до использования, чтобы дать почве просохнуть до влажности, но не полностью высохнуть.

С помощью пульверизатора с ручным насосом нанесите 200 миллилитров раствора дцРНК на нижний полог. Возьмите образцы нового прироста с ранее собранных деревьев через 25-40 дней, собрав примерно 10 листьев с кончиков четырех ветвей. Извлеките общую РНК и проанализируйте ее с помощью ОТ-ПЦР и кПЦР на наличие применяемого триггера дцРНК.

Аналогичным образом распылите 10 миллилитров дцРНК на нижнюю область саженца или листвы дерева в небольших горшках. Выберите растения или рассаду, и не поливайте их за два-три дня до использования, чтобы дать почве просохнуть, отсыреть, но не полностью высохнуть. Далее добавьте один литр раствора дцРНК в почву для крупногоршечных растений.

Добавьте один литр воды через час. Внесите 100 миллилитров раствора дцРНК в почву метровых горшечных деревьев в частично сухих почвах. Дайте растениям получить раствор дцРНК в виде промокания почвы, замочить на 30 минут.

Затем примените простую обработку только водой, чтобы улучшить впитывание корнями. Выберите рассаду цитрусовых, новые или примерно 3,5-летние растения для введения дцРНК с помощью стеблевого крана, также известного как метод стволовых инъекций. Оберните медный наконечник каждого инжектора от четырех до шести раз полосой потолочной пленки шириной 0,6 сантиметра, чтобы предотвратить утечку рядом с наконечником.

Далее заполните инжекторы ствола дерева шестью миллилитрами раствора дцРНК, разбавленного ДНК, водой без РНК. Просверлите отверстия в растениях цитрусовых с помощью сверла объемом 10 миллилитров и следите за тем, чтобы диаметр стебля не превышал двух сантиметров, или примерно половины диаметра стебля. Затем введите раствор в ствол дерева и оставьте инжектор в стволе на шесть-10 часов, чтобы раствор дцРНК впитался.

Дайте насекомым питаться черенками обработанных деревьев через 3, 10 и 30 дней после обработки. Высыпьте 30 грамм глиняного абсорбента в коническую трубку объемом 50 миллилитров до отметки 35 миллилитров. Налейте в пробирку 20 миллилитров раствора дцРНК, разведенного в ДНК, воде без РНК, чтобы намочить весь абсорбент.

Закройте коническую трубку крышкой, наклоните трубку, чтобы удалить воздух, и поместите трубку вертикально, и дайте ей постоять одну-две минуты, пока частицы глины впитают раствор. Добавьте в почвенную смесь достаточно глины, пропитанной дцРНК, чтобы заполнить горшок объемом в один галлон. Перемешайте и переверните почву вручную, чтобы тщательно перемешать пропитанную дцРНК глину с почвой.

Используйте почву для пересадки рассады, выбранной для обработки дцРНК. Полейте почву 200 миллилитрами обычной воды, без дцРНК, через 30 минут или один час. Затем залейте 100 миллилитров обычной воды.

Через 24 часа поставьте растение на обычный график полива. Проверяйте от четырех до шести листьев обработанных горшечных растений с помощью глинистых абсорбентов и дцРНК каждый месяц, после обработки на дцРНК, собирая самые верхушечные листья нового роста растений. КПКР сегментов зеленой фасоли, погруженных в синтезированную in vitro дцРНК, специфичную для коричнево-мраморного клопа, или мРНК BMSB, указывает на успешную индукцию РНК-интерференции, поскольку экспрессия мишеней JHAMT и Vg была значительно снижена in vivo.

Этот способ доставки эффективен и против другого вредителя-полужесткокрылого – клопа-арлекина. О чем свидетельствуют их экскременты зеленого цвета. После просмотра этих наглядных демонстраций у вас должно сложиться четкое представление о том, как доставлять двухцепочечную РНК насекомым через пероральный прием внутрь для индуцирования РНК-интерференции насекомых in vivo.

Успехи, достигнутые в технологии нуцелотидов РНК-интерференции, продолжают расширять возможности исследователей по модулированию РНК, экспрессии генов и уровней белка в широком спектре живых организмов. Это касается и растений, и насекомых, и самых сложных микроорганизмов. Таким образом, в то время как стоимость производства двухцепочечной РНК продолжает снижаться, а методы доставки и стабильности продолжают совершенствоваться, будущее технологий РНК-интерференции будет по-прежнему использоваться для решения возникающих сложных проблем.