Быстрое в естественных условиях оценки адъювант в цитотоксических T лимфоциты поколение возможностей для разработки вакцин

Общая цель данного эксперимента заключается в определении способности интересующих нас адъювантов генерировать цитотоксические Т-лимфоциты путем мониторинга пролиферации ОТ1 CD8-положительных Т-клеток, окрашенных КФСЕ, в дренирующих лимфатических узлах и селезенке иммунизированных животных-реципиентов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области вакцинологии, такие как потенция адъюванта для генерации цитотоксичного клеточного ответа. Главное преимущество этой методики заключается в том, что можно определить не только CTL-емкость адъюванта, но и является ли она местной или системной и сделать это можно только за четыре дня.

Демонстрировать процедуру будет техник нашей лаборатории Елена Рейнхард. Чтобы выделить 1,1-положительные CD8-положительные Т-клетки бедра у мышей OT1, сначала собирают селезенку и паховые, подмышечные и шейные лимфатические узлы в соответствии со стандартными протоколами, помещая все органы в 100-микрометровый сетчатый фильтр с порами в 60-миллиметровой чашке Петри, содержащей от трех до пяти миллилитров полной среды на льду на каждую мышь по мере их сбора. Не собирайте материал в больших селезенках OT1 или лимфатических узлах, потому что Т-клетки из этих лимфатических тканей могут быть лейкозными и размножаться даже без стимуляции, искажая результаты анализа.

Когда все органы будут извлечены у каждого донорского животного, используйте поршень шприца, чтобы протереть образцы через сетчатый фильтр и перенести полученные одиночные суспензии в одну коническую трубку объемом 15 миллилитров на каждую мышь. Гранулируют клетки методом центрифугирования с последующим центрифугированием, промывают в 10 миллилитрах холодного PBS. Лизируйте гранулу эритроцитов в одном миллилитре буфера хлорида аммония на пробирку со льдом.

Через 90 секунд промойте клетки еще в 10 миллилитрах PBS и повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре PBS плюс 5% FBS на пробирку. Затем с помощью отрицательного селективного набора изолируют CD8-положительные Т-клетки в соответствии со стандартными протоколами выделения магнитных шариков и подсчитывают количество отсортированных магнитными шариками CD8-положительных Т-клеток. Затем разбавьте Т-клетки в соотношении от одного до пяти на 10-7 клеток на миллилитр концентрации PBS в отдельных 15-миллилитровых конических пробирках и окрасьте каждый образец клетки пятью микромолярами CFSE в течение семи минут при температуре 37 градусов Цельсия и защитите от света.

В конце инкубации погасите реакцию окрашивания равным объемом FBS и верните клетки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия еще на семь минут. В конце второй инкубации промойте клетки два раза по 10 миллилитров PBS на одну промывку и ресуспендируйте клетки через три-пять по 10-7 клеток на миллилитр объемов PBS. Для адаптивного переноса меченых CFSE Т-клеток OT1 загрузите клетки в один одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 25 калибра, на каждый экспериментальный образец клетки и обездвижьте первую мышь-реципиента в удерживающем устройстве.

Затем, когда хвостовые вены расширится, доставьте 100 микролитров клеток через боковую или дорсальную хвостовую вену. Для иммунизации животных, переведенных в приемный организм, сбривают шерсть над поверхностной ягодичной мышцей мыши, трансплантированной Т-клеткой OT1, и с помощью иглы 25 калибра подкожно вводят 50 микролитров OVA, не содержащей эндотоксинов, в выбритую область. Важно использовать OVA, не содержащую эндотоксинов, потому что следы эндотоксина в OVA могут привести к ложным результатам.

Через сорок восемь часов после иммунизации соберите паховые лимфатические узлы и селезенку у каждого животного-реципиента в соответствии со стандартными протоколами и сгенерируйте индивидуальные суспензии одиночных клеток для каждого лимфатического узла и образца селезенки, как показано выше. Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах PBS на образец. Чтобы окрашивать образцы для проточного цитометрического анализа, инкубируйте клетки со 100 микролитрами коктейля из мастер-микса первичных антител флуорофора в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия.

В конце инкубации промойте клетки два раза в 10 миллилитрах PBS и повторно суспендируйте образцы в количестве от 0,5 до одного миллилитра PBS на пробирку. Отфильтруйте клетки через сетчатые фильтры с плотностью от 70 до 100 микрометров в пробирки для анализа проточной цитометрии с пятью миллиметрами и получите контрольные элементы компенсации одиночного окрашивания, а также образцы в проточном цитометре. Чтобы затворить выборки, откройте график зависимости высоты прямого рассеяния от прямой области рассеяния, а также график ширины бокового рассеяния от боковой площади рассеяния и строб, чтобы исключить дублеты.

Сгенерируйте график зависимости FITC от автофлуоресценции, чтобы отличить популяцию истинно окрашенных CSFE клеток от клеток с высоким уровнем автофлуоресценции. Эти окрашенные клетки OT1 CSFE можно рассматривать как популяции, которые простираются в основном по оси FITC. Чтобы отличить клетки, полученные от донорских животных, и животных-реципиентов, гейтируйте бедро 1,1 плюс CD90 плюс CD8 плюс Т-клетки и повторно загатите популяцию CD8 плюс для исключения CD4 плюс Т-клетки.

Затем отобразите эту популяцию пролиферировавших CD8 Т-клеток в гистограмме в соответствии с их экспрессией в CSFE и определите пролиферировавшие популяции от интенсивности 10 до второй до интенсивности неразделенной контрольной популяции. Регистрируйте не менее 5 000 событий для компенсационных элементов управления и 10 000 событий для каждой пробы при низкой или средней скорости анализа потока. В этом эксперименте две группы мышей были вакцинированы одним из двух различных адъювантов.

Мыши, которым вводили OVA плюс второй адъювант, продемонстрировали более высокую способность к локальному производству цитотоксических Т-клеток в дренирующих лимфатических узлах по сравнению с мышами, которым вводили первый адъювант плюс OVA, только OVA или контрольную вакцину PBS. Напротив, у мышей, которым вводили второй адъювант плюс OVA, не генерировался цитотоксический ответ Т-клеток в системном компартменте, в то время как CD8-положительные Т-клетки, выделенные из селезенки адъювантов 1 плюс OVA, продемонстрировали более высокие уровни пролиферации, чем CD8-положительные Т-клетки селезенки, выделенные только из OVA, контроля PBS и адъюванта 2 плюс OVA. После освоения эта методика позволит вам определить CTL-емкость молекулы адъюванта с помощью антигена OVA всего за четыре дня работы.

После выполнения этой техники вы сможете в дальнейшем применять все другие методы к выделенным Т-клеткам, а затем фенотипировать цитокиновый профиль или метаболический профиль CTL-ответа вашего адъюванта.