Разработка и валидация сверхчувствительная одной молекулы массив цифровых энзим соединенный Assay иммуносорбента для человеческий интерферон α

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о природе, регуляции и биологическом воздействии индуцированных интерфероном реакций при различных заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания и инфекции. Основным преимуществом данной методики является собственная президентская чувствительность. Этот метод имеет большой потенциал для открытия биомаркеров для улучшения ведения пациентов при многих заболеваниях, поскольку он может количественно определять цитокины с беспрецедентной чувствительностью.

Важным шагом в использовании этого подхода была нейтрализация активности, связанной с пациентами с аутоиммунной полииндокринной системой первого типа. Для начала загрузите 280 миллионов парамагнитных шариков в микрофугальную пробирку, обращая внимание на объем. Затем импульсно закрутите бусины и поставьте трубку на магнитный сепаратор на минуту.

Удалите и выбросьте раствор разбавителя, изолировав таким образом шарики. Далее промойте бусины с BWB два раза и BCB дважды. На каждую стирку добавляйте 200 микролитров и закручивайте тюбик в течение пяти секунд.

Затем отделите шарики от раствора с помощью магнитного сепаратора. После одной минуты отделения выбросьте разбавитель. Далее добавьте 190 микролитров BCB на объем бусины.

трубку, пульсируйте трубку и положите промытые бусины на лед. Чтобы активировать шарики, соедините один миллилитр холодного BCB с 10 миллиграмм EDC, и вортексируйте до тех пор, пока раствор не станет однородным. Работайте быстро и безопасно при использовании EDC, благодаря присущей ему нестабильности и эквинусному решению.

Затем добавьте 10 микролитров холодного, разбавленного EDC на объем бусин в суспензию бусин и быстро перемешайте бусины. Далее выложите бусины на шейкер при комнатной температуре на 30 минут. Чтобы конъюгировать антитела к шарикам, сначала вихревые и импульсные вращают активированные шарики.

Затем поместите шарики в магнитный сепаратор на минуту и выбросьте надосадочную жидкость BCB. Далее снимите трубку с магнита и дважды промойте бусины 200 микролитрами BCB. Затем вихрь, импульсное вращение и магнитное разделение шариков, чтобы удалить буфер.

Затем быстро добавьте 200 микролитров холодного, буферного антитела к активированным гранулам. После перемешивания шариков в раствор поместите суспензию на шейкер комнатной температуры на два часа при 1 000 об/мин. Начните с придания суспензии шариков, покрытой антителами, импульсного вращения, а затем используйте магнитную колонку для удаления буфера.

Далее проверьте концентрацию белка в буфере. Используйте спектрофотометр малого объема. На этом этапе антитела соединяются с шариками, и любое значение выше нуля означает, что шарики насыщены антителами.

Теперь промойте бусины с 200 микролитрами BWB, как это делалось во всех предыдущих стирках. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку и проверьте концентрацию белка. Количественное определение белков, высвобождаемых из гранул, позволяет измерить связь антител.

Затем снова промойте бусины 200 микролитрами BWB. Затем добавьте 200 микролитров буфера, блокирующего шарики, перебейте трубку на пять секунд и перенесите ее в шейкер комнатной температуры на 30 минут. Через 30 минут бусины будут заблокированы.

Затем вымойте их один раз, используя 200 микролитров BWB, а затем дважды промойте их с 200 микролитрами буфера, разбавляющего шарики, для каждой стирки. Затем храните покрытые и заблокированные шарики в 200 микролитрах буфера разбавителя гранул при температуре четыре градуса Цельсия. В этом разделе видео предлагаются стратегии настройки условий анализа с помощью программного обеспечения для анализа одномолекулярных матриц в конфигурации домашнего пивоварения.

Начните с тестирования различных комбинаций конъюгированных гранул антител захвата и антител для обнаружения биотинилирования в обеих комбинациях антител. Затем протестируйте комбинации трех различных концентраций антител захвата с двумя различными коэффициентами биотинилирования для обнаружения и захвата антител и наоборот. Затем выберите комбинацию, которая обеспечивает самый низкий уровень обнаружения, и используйте ее для дальнейших действий.

В этом случае соотношение биотина к антителам 30 к одному дает наилучший предел обнаружения. Затем сравните двухэтапную конфигурацию с трехступенчатой. Трехступенчатые конфигурации имеют три различных этапа инкубации.

Один с антителом захвата, другой с антителом обнаружения и последний, третий, для мечения ферментом SBG. Двухступенчатые конфигурации сочетают в себе инкубацию для отлова и обнаружения. Запустите одномолекулярный матричный анализатор с использованием выбранных концентраций и соотношений антител захвата и детектора в двух- и трехступенчатых конфигурациях, предварительно настроенных в анализаторе, следуя инструкциям производителя.

Затем выберите конфигурацию, которая обеспечивает максимальную чувствительность, и сохраните ее для будущих шагов. В этом случае двухступенчатая конфигурация дает немного более высокую чувствительность в каждой контрольной точке. Затем оптимизируйте концентрации антител детектора и SBG.

Протестируйте три разные концентрации детекторных антител с тремя различными концентрациями SBG. Выберите концентрации, которые обеспечивают наибольшую чувствительность, и сохраните их для будущих шагов. При этом 0,3 мкг на миллилитр антитела и 150 пикамолярных моляров SBG имеют оптимальный уровень обнаружения при низких фоновых уровнях с случайной средней амплитудой.

Для получения дополнительной информации о шагах оптимизации обратитесь к текстовому протоколу. В нем представлены процедуры для оптимизации специфичности и воспроизводимости анализа, а также анализ для конкуренции белков. Используя анализ, оптимизированный для обнаружения 13 подклассов интерферона-альфа, плазма и сыворотка крови были проанализированы у пациентов с СКВ, пациентов с ЮДМ и здоровых контрольных групп.

Высокие уровни белка интерферона-альфа были обнаружены в обеих когортах заболевания. Пунктирной линией обозначен уровень обнаружения обычного, коммерчески доступного препарата Eliza, который не обнаруживал бы белок интерферон-альфа в этих группах пациентов, несмотря на известную роль этого цитокина в этих заболеваниях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как разработать и проверить анализ матрицы из одной молекулы для выбранного вами анализа.

Пробуя эту процедуру, важно помнить, что во время клетки происходит выбор антител. С момента своего развития этот анализ позволил лучше охарактеризовать роль интерферона-альфа в различных аутоиммунных заболеваниях и инфекциях. Этот анализ также служит для мониторинга реакции на новые методы лечения и выявления клеточных акторов, ответственных за определенные аутоиммунные расстройства.