Методы для обнаружения цитотоксических Амилоиды следующие инфекции из легочного эндотелиальных клеток, синегнойной палочки

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области пульмонологии, например, почему пациенты, выжившие после внутрибольничной пневмонии, имеют такие плохие долгосрочные результаты? Преимущество этого метода в том, что он прост и надежен, а это значит, что любой, кто приходит в лабораторию, может быть обучен этому, и на следующий день он генерирует полезные и воспроизводимые данные. Хотя эти аналитические методы могут быть применены для получения информации об инфекции культивируемых клеток in vitro, они также могут быть применены к животным моделям и пациентам

Чтобы получить цитотоксический надосадочную жидкость, промойте 150-сантиметровую чашку с эндотелиальными клетками HBSS и разбавьте колонию P.aeruginosa до поглощения 0,25 на 540 нанометрах. Далее разбавьте бактериальные клетки, чтобы обеспечить кратность инфекции от 20 до одного на 20 миллилитров HBSS, и засейте бактерии на пластине эндотелиальных клеток. Затем поместите зараженные клетки в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия и 5% CO2 на четыре-пять часов.

Важно, чтобы инкубация бактерий и эндотелиальных клеток происходила в течение соответствующего периода времени. Если инкубация будет слишком короткой, амилоиды не будут выделяться в надосадочную жидкость. Если инкубация длится слишком долго, клетки фактически лизируются и высвобождают все свое содержимое в надосадочную жидкость.

Показателем, который мы используем для соответствующей продолжительности инкубации, является образование щелей в эндотелиальном монослое. Когда в монослое клетки можно наблюдать пробелы с помощью световой микроскопии, соберите надосадочную жидкость для центрифугирования, чтобы удалить любой клеточный мусор. Сцедите надосадочную жидкость в шприц, оснащенный фильтром 0,2 микрона, и пропустите надосадочную жидкость через фильтр, чтобы удалить любые загрязняющие бактерии.

Затем отложите 1,5 миллилитра стерильного надосадочной жидкости для проверки на цитотоксичность и заморозьте оставшуюся часть образца при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы оценить цитотоксичность собранной надосадочной жидкости, добавьте 1,5 миллилитровую аликвоту стерилизованной фильтрованной надосадочной жидкости в одну лунку шестилуночного планшета, содержащую сливающуюся культуру легочных микрососудистых эндотелиальных клеток. Поместите планшет в CO2-инкубатор на 21–24 часа.

Затем получают изображения областей обрабатываемой и контрольной культур. Импортируйте изображения в пользовательский макрос imagej и настройте контрастность до 15% насыщенных пикселей. Дублируйте изображения с поправкой на контраст и используйте вычитание фона для получения высококонтрастных изображений как неповрежденных клеток, так и области зазора в поле зрения.

Вычтите это высококонтрастное изображение из исходного изображения и используйте калькулятор изображений и функцию для объединения полученного изображения с исходным изображением. Используйте функцию порога для преобразования объединенного изображения в маску с пропусками черного цвета и неповрежденными ячейками белым. И используйте функцию двоичной эрозии, чтобы удалить любой шум с изображения.

Затем используйте долю площади для измерения соотношения черных и белых пикселей в результирующем изображении. А также постройте график и выразите дробные площади для каждой временной точки лечения в процентах от максимальной площади зазора. Чтобы количественно определить содержание амилоидов в надосадочной жидкости, добавьте 20 микролитров свежеприготовленного и отфильтрованного стокового раствора тиофлавина Т 50X к одному миллилитру PBS в кювете спектрофотометра объемом 1 миллилитр и загрузите разведенный образец на спектрофлуориметр.

Измерьте базовое флуоресцентное излучение с помощью возбуждения 425 нанометров. Сканирование флуоресцентного излучения от 450 до 575 нанометров с шагом в два нанометра. Затем настройте прибор на выполнение покадрового сканирования с использованием возбуждения 425 нм и излучения 482 нм со сбором данных каждые 0,2 секунды в течение 60 секунд.

Поставьте сканирование на паузу через 20 секунд и процедите 10 микролитров простиранной надосадочной жидкости в кювету. После перемешивания методом инверсии снова загрузите кювету на спектрофлуориметр и возобновите сканирование по времени в течение последних 40 секунд. По завершении таймлапса выполните окончательное сканирование спектра флуоресцентного излучения с использованием исходных настроек сканирования.

Добавление P.aeruginosa к сливающимся слоям эндотелиальных клеток легочных микрососудов индуцирует образование щели между клетками. Используя imagej для оценки цитотоксичности надосадочной жидкости, как это было продемонстрировано в течение первых 12 часов лечения, все еще здоровые монослои сливающихся клеток могут быть визуализированы как все белые области в микроскопическом поле. Тем не менее, через 18 часов после добавления надосадочной жидкости, собранной из инфицированных культур PA 103, могут быть обнаружены пробелы в монослое, при этом площадь чашки для культиваторов, лишенная клеток, увеличивается линейно до 36 часов обработки, после чего практически не может наблюдаться интактных клеток.

Аналогичные результаты могут быть получены при использовании высвобождения лактатдегидрогеназы в качестве маркера цитотоксичности. При этом лактатдегидрогеназа впервые обнаруживается через 18 часов после добавления цитотоксического надосадочной жидкости и линейно увеличивается до тех пор, пока максимальное уничтожение клеток не будет измерено через 36 часов. Надосадочная жидкость также может быть оценена с помощью иммуноблоттингового анализа или путем измерения изменения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т из-за подтверждающих изменений, вызванных связыванием амилоида, для определения присутствия цитотоксических амилоидов в надосадочной жидкости.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генерировать цитотоксические надосадочные жидкости после инфицирования эндотелиальных клеток цитомонсом энегнойной. Кроме того, вы должны хорошо разбираться в типах анализов, необходимых для определения и анализа цитотоксинов, присутствующих в этих надосадочной жидкости.