Магнитные активированный ячейку Сортировка стратегии изоляции и очищают синовиальной жидкости производные мезенхимальных стволовых клеток из кролика модели

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы протокола сортировки в области стволовых клеток, обеспечивая процедуру очистки мезенхимальных стволовых клеток непосредственно из синовиальной жидкости. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы разработали простой и экономичный протокол выделения и очистки MACS из синовиальной жидкости кролика. В целом, в исследованиях, благодаря этому методу, мы прилагаем большие усилия, потому что плюминация клеточной популяции зависит от производства одиночной клеточной суспензии.

Идея этого метода пришла нам в голову, когда мы заметили, что только метод сортировки клеток, активируемый магнитом, в настоящее время одобрен FDA для клинического применения. Начните эту процедуру с анестезии животных, как описано в текстовом протоколе. Чтобы выполнить сбор суставной синовиальной жидкости из колена кролика, выберите участок размером примерно пять на пять сантиметров вокруг колена.

Сбрейте кроличью шерсть вокруг этой области с помощью безопасной электробритвы. Поочередно продезинфицируйте место процедуры раствором повидон-йода и 75%-ным этанолом трижды. Затем наложите стерильные простыни после того, как область полностью высохнет.

С помощью стерильного шприца для подкожных инъекций введите от одного до двух миллилитров изотонического физиологического раствора в полость коленного сустава из латерального суставного пространства. Пошевелите коленом три-четыре раза, а затем всосайте всю синовиальную жидкость комнатной температуры. Отфильтруйте синовиальную жидкость через нейлоновое сетчатое фильтр 40 микрон, чтобы удалить любой мусор, в течение четырех часов.

Для культивирования кроликов SF-MSC собирают отфильтрованную жидкость в центрифужные пробирки объемом 50 миллилитров и центрифугируют при 1,500 об/мин в течение десяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу PBS. После повторного суспендирования гранул с полной питательной средой разложите среду по 100 миллилитровым посудам.

Инкубируйте чашки при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Через 48 часов пополните посуду свежей средой, чтобы удалить все неприлипшие клетки. Заменяйте носитель два раза в неделю в течение двух недель по мере прохождения ноль.

Через 14 дней после первоначального осаждения в чашках для культуры должно образоваться много колоний. Выберите колонии размером более двух миллиметров в диаметре. Отметьте, где находятся выбранные колонии, проведя по их окружности на дне посуды.

Отбракуйте колонии шириной менее двух миллиметров с помощью скребков для ячеек. Переварите выбранные колонии с примерно пятью микролитрами 0,25% трипсина с помощью цилиндра для клонирования и переложите колонии в новую чашку для прохода. Когда клетки достигнут примерно 80% конфлюенции, аспирируйте среду.

Затем добавьте от одного до двух миллилитров 0,25% трипсина ЭДТА в каждое блюдо. Инкубируйте чашки в течение двух-трех минут, чтобы дать возможность отслоиться клеткам. После того, как клетки отделятся, добавьте равное количество питательной среды к неактивному трипсину.

Пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 40 микрон и соберите фильтрат в 15-миллилитровую пробирку. Затем раскрутите ячейки при 600-кратном G в течение десяти минут при комнатной температуре. Повторно суспендируйте гранулу элемента в рабочем буфере MACS.

Чтобы выполнить магнитную мечение, определите номер клетки с помощью гемоцитометра. Центрифугируйте клеточную суспензию при 300 умноженных на G в течение десяти минут при четырех градусах Цельсия. После полной аспирации надосадочной жидкости добавьте 80 микролитров буфера ресуспензии на десять миллионов всего клеток.

Для получения десяти миллионов клеток добавьте 20 микролитров микрогранул, конъюгированных с моноклональным антителом против кролика CD90. Равномерно перемешайте магнитные шарики и ячейки в пробирках. Затем инкубируйте их при температуре четыре градуса Цельсия в течение 15 минут в темноте.

Добавьте в пробирку один миллилитр буфера на десять миллионов клеток, а затем центрифугируйте при 300-кратном G в течение десяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы промыть клетки. Выбросьте надосадочную жидкость после центрифугирования. Ресуспендируйте гранулу в 500 микролитрах буфера на десять миллионов клеток.

Поместите колонну крыльями колонны вперед в магнитное поле магнитного сепаратора. Промойте колонку магнитного сепаратора 500 микролитрами буфера на десять миллионов клеток. Перенесите одиночную суспензию в колонку.

Пропустите отрицательные клетки через магнитное поле, чтобы отбросить эти немеченые клетки. Промойте колонку один-два раза с 500 микролитрами буфера на десять миллионов клеток, и отбросьте сквозной поток. Переложите колонку в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Добавьте в столбец один миллилитр буфера на десять миллионов ячеек. Затем немедленно вставьте поршень в колонку, чтобы вымыть ячейки с магнитной маркировкой. Повторите вышеупомянутую процедуру со второй магнитной сепараторной колонкой, чтобы повысить чистоту CD90-положительных клеток, которые могут обогатить элюированную фракцию.

После центрифугирования клеточной суспензии при 300-кратном G в течение десяти минут аспирируют надосадочную жидкость и повторно суспендируют гранулу с питательной средой. Инокулируйте клетки в посуду объемом 100 миллилитров после сортировки клеток, активированных магнитом. Инкубируйте чашки при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном клеточном инкубаторе с 5% углекислым газом.

Когда достигнуто 80-90% слияние первичной культуры, примерно через семь-десять дней, расщепите адгезивные клетки с 0,25% трипсина ЭДТА и пройдите их в разведении от одного до двух, чтобы получить второй пассаж. Используйте тот же метод для передачи клеток в третий пассаж, который можно использовать для анализов in vitro. Здесь показана морфология монослойных культивируемых кроликами SF-MSC до и после MACS под инвертированным микроскопом.

Перед сортировкой популяции клеток синовиальной жидкости кролика проявляют гетерогенность. Они содержат различные типы и размеры клеток, такие как овальная, длинноверетенообразная, коротковеретеновая и звездчатая морфология. Основной морфологией второго и шестого отрывков является веретенообразная морфология.

После MACS с CD90 клеточные популяции демонстрируют однородную морфологию. С субкультурой количество клеток увеличивается. Анализ проточной цитометрии показал, что клетки SF-MSC кроликов были положительными на маркеры МСК CD44 и CD105.

В то время как отрицательный для маркера эндотелиальных клеток CD34 и для маркера гемопоэтических клеток CD45. Результаты показали, что до MACS популяция SF-MSC кроликов состояла примерно на 40% из клеток MSC. После MACS обогащенная популяция содержала более 99% клеток МСК.

Здесь представлен анализ проточной цитометрии CD90-положительного маркера до и после сортировки MAC. Окрашивание Ализарином красным показало, что минерализованные конкреции образовывались под действием остеогенной индукции в течение трех недель. После трех недель адипогенной индукции было обнаружено накопление богатых липидами вакуолей путем внутриклеточного окрашивания Oil Red O.

После трех недель хондрогенной индукции клеточную гранулу гистологически анализировали с помощью окрашивания толуидиновым синим. Положительный кислотный протеогликан характеризовал хондроцитоподобные клетки. Через три недели индукции была обнаружена относительная экспрессия мРНК маркера остеобласта, адипогенного маркера и хондрогенного маркера.

После освоения этой техники ее можно сделать за два-четыре часа. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о простом выделении и очистке мезенхимальных стволовых клеток из синовиальной жидкости новозеландского белого кролика. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о выборе колоний диаметром более двух миллилитров.

Кроме того, перед иммуномагнитной сортировкой производят суспензию для одной клетки, так как нежелательные клетки, прикрепленные к меченой клетке, останутся на магнитном шарике. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как сортировка флуоресцентных активированных клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся безопасности и эффективности очистки мезенхимальных стволовых клеток. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области регенерации суставного хряща к изучению идеальных клеток CD в восстановлении суставного хряща.

Не забывайте, что операции проводились на дугообразном охлаждающем стенде, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки. Применение этого метода распространяется на терапию повреждения суставного хряща, поскольку полученные из синовиальной жидкости MASC являются многообещающими кандидатами для регенерации суставного хряща.