Использование антител анти фосфо girdin для визуализации кишечных клок клетки в свободно плавающего мыши тощей кишки Cryosections

Общей целью этой процедуры окрашивания является визуализация клеток пучка в криосекциях тощей кишки мышей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гастроэнтерологии, например, как происходит пролиферация клеток пучка в кишечнике млекопитающих во время заражения паразитами. Основное преимущество этой методики заключается в том, что исследователи с ограниченным гистологическим опытом могут получать высококачественные изображения хохолковых клеток.

Начните с обнажения тазовых органов только что зафиксированного формалином мышиного трупа. Отрежьте конец прямой кишки от анального отверстия, а кишечник отделите от тела, разрезав брыжейку. Чтобы изолировать тощую кишку, разрежьте кишечник в четырех сантиметрах от анальной стороны желудочного антрального отдела, а анальную половину оставшейся тонкой кишки выбросьте.

Разрежьте тощую кишку пополам, чтобы облегчить процедуру промывки. Загрузите 20 миллилитров 10% буферизованного нейтрального раствора формалина в шприц объемом 20 миллилитров и прикрепите прямую иглу 18-го калибра со снятым скосом. Затем введите 10% буферизованный нейтральный раствор формалина с одного конца обрезанной тощей кишки, чтобы вымыть содержимое кишечника и зафиксировать поверхность просвета кишечника.

Промойте просвет кишечника с помощью инъекции PBS. Затем промойте жидким желатиновым раствором взамен ПБС. Закройте один конец обрезанной тощей кишки лигированием с помощью нейлонового разреза 6-0

Заполните тощую кишку жидким желатином и закройте противоположный конец лигированием шва. Далее завяжите четыре шовных узла по всей длине тощей кишки. Замочите ткани в 50 миллилитрах 15% сахарозы в 10% буферизованном растворе нейтрального формалина на ночь, при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день разрежьте тощую кишку по шовным узлам, чтобы получить три колбасных кусочка тоджеюна с перевязанными обоими концами. Выровняйте детали в криоформе, затем накройте закладочным составом. Мгновенно заморозьте криомолд в изопентане, охлажденном жидким азотом.

Чтобы подготовить срезы тощей кишки, начните с установки температуры криостатной камеры и температуры объекта на отметку минус 22 градуса Цельсия. Поместите блок замороженной ткани в криомолд в камеру криостата не менее чем на 15 минут. Через 15 минут разрежьте блок пополам лезвием бритвы, чтобы обнажить поперечный срез тощей кишки.

Установите одну половину блока на адаптер для криостата. Разделите наполненную желатином тощую кишку на участки толщиной 30 микрон. С помощью замороженных щипцов аккуратно переложите срезы в 35-миллиметровую чашку для культуры, содержащую 3 миллилитра PBS.

Промыв секции три раза в течение пяти минут каждый 3 миллилитрами PBS-T, добавьте 3 миллилитра свежеприготовленного раствора для извлечения антигена в посуду, содержащую свободно плавающие секции. Затем закройте крышку, заклейте зазор между блюдом и крышкой полоской виниловой ленты и выдерживайте при температуре 50 градусов Цельсия в гибридизационном инкубаторе в течение трех часов, не встряхивая. После иммуноокрашивания перенесите чашку с окрашенными срезами в PBS в стереоскопический микроскоп.

Поместите 200 микролитров PBS в каплю в центр предметного стекла с кодировкой MAS из белого стекла. Затем с помощью наконечника для дозатора P200 перенесите одну секцию тощей кишки из чашки в каплю. Отрегулировав выравнивание секции, аспирируйте все оставшиеся PBS вокруг секции.

Добавьте 20 микролитров водного монтажного материала и наденьте на него защитное стекло. Немедленно загерметизируйте скользящие края крышки монтажным материалом на основе ксилола и дайте высохнуть в течение двух-трех часов перед началом конфокальной микроскопии. Желатиновое наполнение тощей кишки сохраняет круглую форму диска и поддерживает вертикальное положение ворсинок.

При отсутствии желатинового наполнения срезы тощей кишки имеют тенденцию к излому, позволяя ворсинкам раскачиваться назад. pY1798 воспроизводимо очерчивает целые клетки пучка, включая мембрану, цитоплазму золотниковидной сомы и сильно окрашенный просветный конденсацию, где сильная конденсация сигнала соответствует выступающему пучку пучковой клетки. Фаллоидин обладает высоким сродством к нитевидному актину, который присутствует в микроворсинках, образующих границу кишечной щетки.

Фаллоидин воспроизводимо и заметно отмечает утолщенную кайму кисти, которая соответствует массе корешков, отходящих от хохолка. Последовательная колокализация сигналов pY1798 с заметно утолщенной, фаллоидин-положительной границей кисти демонстрирует, что этот протокол успешно идентифицирует пучковые клетки независимо от того, расположены ли они на ворсинках или в крипте. После освоения этой техники ее можно сделать за три дня, если она выполнена правильно.

Комбинация желатина с низкой эмиссионной точкой, свободно плавающих криосеков и низкотемпературного извлечения антигена может быть применена для иммуноокрашивания других проектных тканей.