Количественная оценка внутриклеточных роста внутри макрофагов является быстрый и надежный метод оценки вирулентности лейшмании паразитов

Общая цель этого эксперимента — оценить вирулентность различных штаммов Leishmania через инфицирование макрофагов, полученных из костного мозга мышей, in vitro и последующую количественную оценку кинетики внутриклеточного роста паразитов. Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы о факторах как макрофага хозяина, так и патогена, которые определяют вирулентность инфекционных паразитов Leishmania. Основное преимущество этой методики заключается в том, что это быстрый, экономичный и надежный метод, требующий значительно меньшего количества животных по сравнению с исследованиями in vivo.

Применение этого метода распространяется и на терапию лейшманиоза, поскольку он может быть использован для оценки инфекционности мутировавших штаммов лейшмании или эффективности терапевтических соединений. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как этапы выделения макрофагов из костного мозга и количественного определения внутриклеточного паразита трудно узнать только по письменным протоколам. Начните с того, что прикрепите самку мыши в возрасте от четырех до шести недель к доске для вскрытия и продезинфицируйте животное 70% этанолом.

С помощью ножниц сделайте разрез в один сантиметр возле одного тазобедренного сустава и разрежьте кожу по всему суставу. Потяните кожу от ноги к лодыжке, чтобы аккуратно снять перчатку с конечности, и отрежьте стопу на уровне или ниже голеностопного сустава, чтобы оставить большеберцовую кость в целости. Чтобы определить местоположение тазобедренного сустава, манипулируйте бедренной костью, чтобы определить точку вращения, и с помощью ножниц отрубите ногу выше тазобедренного сустава, оставляя проксимальную головку бедренной кости в такте.

Удалите как можно больше мышц и соединительной ткани с ноги, а очищенные кости поместите в чашку Петри, содержащую стерильный RPMI с добавлением антибиотиков на льду. После сбора второго набора костей ног используйте стерилизованные щипцы и лезвие номер десять, чтобы удалить все оставшиеся мышцы и соединительную ткань. Переложите очищенные кости на пустую крышку чашки Петри и с помощью скальпеля удалите оба конца каждой большеберцовой кости, чтобы получить доступ к костному мозгу.

С помощью щипцов поместите одну большеберцовую кость над устьем 50-миллилитровой конической трубки на льду и вставьте кончик иглы 25 калибра, прикрепленной к 10-миллилитровому шприцу, наполненному средами, дополненными антибиотиками, в один конец большеберцовой кости. Промойте примерно от 5 до 10 миллилитров среды через кость в коническую трубку, пока вся красная ткань костного мозга не будет собрана и кость не станет белой. Когда весь костный мозг будет собран, центрифугируйте объединенный костный мозг и повторно суспендируйте палитру клеток костного мозга в пяти миллилитрах макрофагальной среды, полученной из костного мозга.

Перенесите суспензию клеток костного мозга в колбу для клеточных культур площадью 175 квадратных сантиметров, содержащую 60 миллилитров стерильной макрофагальной среды, полученной из костного мозга, и дважды промойте пробирку средой из колбы для культур, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток. После второй промывки переложите 30 миллилитров аликвоты клеток во вторую колбу для клеточных культур площадью 175 квадратных сантиметров и закройте каждую колбу фильтрующей крышкой. Затем инкубируйте обе культуры в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, чтобы отделить резидентные макрофаги от любых загрязняющих фибробластов или других адгезивных клеток.

На следующее утро переложите 10 миллилитров недифференцированного надосадочного вещества, содержащего клетки костного мозга, из каждой колбы в отдельные чашки Петри, обработанные полистиролом размером 100 на 15 миллиметров, и верните клетки в инкубатор для клеточных культур еще на два-три дня. Затем накормите культуры пятью миллилитрами свежей макрофагальной среды, полученной из костного мозга 37 градусов Цельсия, на одну чашку и верните тарелки в инкубатор. На седьмой или восьмой день после культивирования используйте аспирационный наконечник, установленный на вакуумной линии, чтобы перенести четыре стерилизованных 12-миллиметровых стеклянных крышки автоклава на дно каждой лунки шестилуночного планшета для культивирования без наложения

Подготовьте одинаковые пластины для каждого временного момента эксперимента. Затем промойте культуры макрофагов, полученных из костного мозга, два раза свежим PBS с температурой 37 градусов Цельсия и пятью миллилитрами PBS без кальция и магния с добавлением одного миллимолярного ЭДТА на каждую пластину. Через пять минут при температуре 37 градусов Цельсия соберите отделенные клетки в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, дважды промыв каждую пластину дополнительными пятью миллилитрами PBS без кальция и магния.

После центрифугирования повторно суспендируйте макрофаги в 5-10 миллилитрах свежей макрофагальной среды, полученной из костного мозга, на льду. После подсчета разбавьте клетки до пятикратной концентрации от 10 до пятой части на миллилитр в свежей макрофагальной среде, полученной из костного мозга, и добавьте два миллилитра клеток на лунку в шестилуночный планшет. Затем инкубируйте клетки в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур.

Чтобы заразить клетки L.amazonesis, разбавьте суспензию паразита до соответствующей экспериментальной кратности инфекции и добавьте от 50 до 100 микролитров паразитов в каждую лунку всех шести луночных планшетов, включая все временные точки эксперимента. Инкубируйте макрофаги, полученные из костного мозга, в течение соответствующего периода инфекции и соответствующей температуры. Затем промойте лунки три раза двумя миллилитрами свежего PBS 37 градусов Цельсия без кальция или магния на лунку и зафиксируйте исходную временную точку образца от 1,5 до 2 миллилитров 2%-ного параформальдегида на 10 минут.

Для планшетов, соответствующих более поздним временным точкам, добавьте в каждую лунку по два миллилитра свежей макрофагальной среды, полученной из костного мозга, и верните планшеты в соответствующий инкубатор. Затем зафиксируйте и промойте ячейки для каждой из оставшихся временных точек, как показано только что, и храните образцы при температуре четыре градуса Цельсия в свежем PBS. Чтобы окрашивать клетки DAPI, замените надосадочную жидкость на 1,5 миллилитра свежего PBS без кальция и магния, дополненную 0,1% неионогенным моющим средством на 10 минут при комнатной температуре, после чего последует три двухмиллилитровых промывки PBS без кальция или магния.

Далее окрашивайте клетки двумя микрограммами на миллилитр DAPI в одном миллилитре PBS в течение одного часа при комнатной температуре. После трех стирок поместите крышку скользящей стороной вниз на отдельное предметное стекло микроскопа, установленное с помощью реагента, предотвращающего выцветание. Затем, чтобы количественно определить количество инфицированных клеток, используйте объектив флуоресцентного микроскопа со 100-кратным погружным маслом и ручной счетчик, чтобы определить количество более мелких ядер амастиготы, сгруппированных вокруг каждого большого окрашенного ядра DAPI.

Leishmania имеет две инфекционные формы: метациклические промастиготы, которые дифференцируются от проциклических промастигот в стационарной фазе культивирования, и амастиготы, внутриклеточную инфекционную форму, обнаруженную внутри позвоночного хозяина. В этом случае аксенически дифференцированные амастиготы могут быть визуализированы в макрофаге, полученном из костного мозга, через час после первичной инфекции и до образования паразитофорных вакуолей в результате фаголизосомального слияния. Через 48 часов можно наблюдать отчетливые крупные паразитофорные вакуоли, содержащие множество паразитов, что характерно для вирулентной инфекции лейшмании.

Невирулентные промастиготы логарифмической фазы, напротив, не способны инициировать развитие паразитофорных вакуолей, не могут реплицироваться и в конечном итоге погибают в макрофагах хозяина. В этом эксперименте наблюдалось устойчивое увеличение числа внутриклеточных метациклических паразитов Leishmania дикого типа в течение 72 часов после заражения, в то время как внутриклеточный рост мутантных паразитов с нарушенным митохондриальным импортом железа практически отсутствовал, что позволяет предположить, что для роста паразитов в макрофагах требуется митохондриальная активность. Макрофагальные инфекции, проведенные диким типом и мутантными аксеническими амастиготами, показали внутриклеточный рост, аналогичный тому, который наблюдается у метациклических промастигот, но с еще более высокой инфекционностью паразитов дикого типа, чем у метациклических промастигот.

Важно отметить, что для метациклических промастиготных инфекций существует начальная задержка в 24 часа, представляющая собой время, необходимое для первичной дифференцировки интернализованных метациклических промастигот в амастиготы, прежде чем начать репликацию. После освоения этой техники ее можно завершить за 15 дней, если она выполнена правильно. При попытке выполнить эту процедуру важно использовать соответствующие линии мышей и провести тщательное количественное определение как макрофагов, так и клеток паразита, чтобы обеспечить согласованность MOI во всех экспериментах.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как культивировать макрофаги, полученные из костного мозга, и инфицировать их Leishmania для количественной оценки их внутриклеточного роста паразита после ядерного окрашивания DAPI. Не забывайте, что работа с Leismania может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование шкафа биологической безопасности и средств индивидуальной защиты, а также избегание острых инструментов.