Оценке сосудистых Hyperpermeability-возбудителей в коже с Assay км

Общая цель этой процедуры заключается в измерении сосудистой утечки в дерме мыши, которая индуцируется внутрикожным введением агентов, способствующих проницаемости. Эта процедура может помочь ответить на ключевые вопросы о регуляции проницаемости сосудов in vivo, например, какие молекулы могут стимулировать или ингибировать сосудистую утечку и какие сигнальные пути задействованы. Основное преимущество этой процедуры заключается в том, что она быстрая и относительно простая, и в ней в основном используются обычные лабораторные реактивы и материалы.

Применение этой методики распространяется и на терапию заболеваний с патологическими отеками. В частности, исследователи могут использовать этот анализ для идентификации новых молекулярных мишеней и тестирования соответствующих препаратов на их способность подавлять проницаемость сосудов относительно быстрым и простым способом. Приготовьте отдельные растворы ингибитора гистамина пириламина малеата и синего красителя Эванса в 0,9% физиологическом растворе.

Затем, работая в шкафу с ламинарным потоком, стерилизуйте растворы, пропуская через фильтр 0,22 мкм. Загрузите два раствора в отдельные одномиллилитровые шприцы, оснащенные иглами 30 калибра. Далее загрифуйте мышку.

Затем наклоните мышь так, чтобы голова была направлена к земле, а брюшко вверх. После того, как мышь будет размещена, введите 10 микролитров на грамм массы тела раствора пириламина малеата путем внутрибрюшинной инъекции. Далее, чтобы способствовать расширению сосудов, поместите мышь в термокамеру при температуре 37 градусов Цельсия на 10 минут.

Затем переместите мышь к удерживающему устройству для мыши. Далее натрите хвост 70%этанолом для дальнейшего расширения сосудов. Введите 100 микролитров раствора синего красителя Эванса внутривенно через хвостовую вену.

Чтобы предотвратить кровотечение, быстро зажмите хвост между пальцем и большим пальцем и надавите на место инъекции. Внутривенное введение синего красителя Evans Blue Dye в хвостовую вену мыши является сложным и ответственным этапом в рамках этой процедуры. Соответственно, важно, чтобы исследователи были компетентны в выполнении этой инъекции, прежде чем приступать к остальной части процедуры.

Для формирования компетентности потребуется предварительная практика. Используйте стерильные растворы фосфатно-солевого буфера для разбавления реагента VEGF таким образом, чтобы конечный объем дозы составил 20 микролитров. Затем загрузите реагент, вызывающий проницаемость VEGF, и систему управления транспортным средством в два отдельных шприца объемом 300 микролитров, оснащенных иглами 31 калибра.

Держите иглу под углом 15 градусов к коже и введите 20 микролитров VEGF внутрикожно в боковую область мыши. Найдите приподнятый пузырь внутри кожи, чтобы подтвердить успешную инъекцию. Выполняйте внутрикожные инъекции в два дополнительных места на расстоянии не менее одного сантиметра друг от друга.

Затем поверните мышь, чтобы обнажить второй бок и повторите тройные инъекции раствора автомобиля. Ведите запись о каждом из мест инъекции на бумаге и о времени окончания процедуры инъекции. Затем перенесите мышь в домашнюю клетку.

Продолжайте наблюдать за мышью, пока она не придет в сознание и не начнет передвигаться по клетке. Дайте решению VEGF подействовать в течение 20 минут, прежде чем вызывать мышь. На этом этапе последовательно вводите VEGFA и носитель всем мышам по той же процедуре.

Через 20 минут положите каждую усыпленную мышь на спину и прикрепите ее ноги к пробковой доске, завернутой в чистую салфетку. Далее с помощью тупых ножниц сделайте вертикальный разрез длиной три-четыре сантиметра от нижней части живота до груди мертвой мыши. Затем с помощью щипцов и скальпеля дразните кожу с обеих сторон бока.

Используйте скальпель для удаления жира, если он присутствует в областях вокруг места утечки. Затем с помощью щипцов и скальпеля иссеките участки кожи с помощью вытекшего синего красителя Эванса. Иссеченные участки кожи должны быть одинакового размера.

Переложите образцы кожи в пробирки объемом 1,5 миллилитра и нанесите соответствующую маркировку. Высушите образец, поместив открытую пробирку в термоблок на ночь. После завершения сушки добавьте 250 микролитров деионизированного формамида в образец в вытяжном шкафу.

Закройте крышку пробирки и поместите ее в термоблок на ночь, чтобы извлечь краситель Эванса. Центрифугируйте образцы при плотности 10 000 г или выше в течение 40 минут в настольной центрифуге. После центрифугирования перенесите по 100 микролитров каждого красителя-содержащего надосадочной жидкости из центрифугированного образца в лунки 96-луночного планшета, работающего в вытяжном шкафу.

Считывание поглощения синего цвета Эванса с помощью спектрофотометра. Для изучения утечки из сосудов, вызванной VEGF, мышке вводят 50 нанограммов VEGFA в фосфатно-солевом буфере или только в фосфатно-солевом буфере в качестве носителя. На изображении показано увеличение накопления утечки синего красителя Эванса в образцах кожи, которым вводили VEGFA, по сравнению с контрольным автомобилем на месте.

На этом изображении с 96-луночной пластиной показан загруженный синий краситель Эванса, извлеченный в формамиде из образца кожи. На этом графическом графике показаны нормализованные значения поглощения для парных образцов VEGFA и контрольных образцов, предназначенных только для транспортных средств. График показывает, что впрыск 50 нанограммов VEGFA значительно увеличивает утечку красителя Эванса по сравнению только с автомобилем.

Этот график получается после количественной оценки кратных изменений оптической плотности для VEGFA по сравнению с образцами транспортных средств. На графике показано в среднем трехкратное увеличение сосудистой утечки после введения VEGFA по сравнению с только носителем. После освоения основной сегмент этой техники можно выполнить за два часа, если он выполнен правильно.

При выполнении этой процедуры важно нормализовать индуцированную агентом сосудистую утечку до индуцированную носителем сосудистую утечку, чтобы учесть неспецифическую сосудистую утечку и вариации между мышами. Эту процедуру можно сочетать с другими методами, такими как введение лекарств, чтобы ответить на такие вопросы, как можно ли нацелить белок на ингибирование проницаемости сосудов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области сосудистой биологии к изучению молекулярных механизмов сосудистой гиперпроницаемости у генетически модифицированных мышей, определяя ключевые сигнальные компоненты, необходимые для сосудистой утечки.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как вызвать и измерить сосудистую утечку в дерме мыши.