Использование УЗИ руководствоваться ткани направленных сотовой имплантации для создания ксенотрасплантатов биологически соответствующих метастатические опухоли

Целью данного метода является установление биологически значимых ортотопических ксенотрансплантатов для доклинических исследований. Клетки нейробластомы, полученные от пациента, вводятся в мышиный надпочечник под ультразвуковым контролем без открытой операции или длительного восстановления. Этот метод может помочь ответить на важнейшие вопросы в биологии рака и в трансляционных исследованиях, таких как изучение эволюции опухолей, терапевтических реакций в нативном микроокружении и метастазов.

Такие знания значительно повысили бы надежность доклинических исследований и облегчили бы разработку лекарств. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он является эффективным и надежным для пациента в создании ортотопической ксенографической модели для исследований в области терапии рака. Важнейшие этапы процедуры продемонстрируют Сахити Чуккапалли, старший техник и руководитель нашей лаборатории, а также Тина Томас, научный сотрудник нашей лаборатории.

Создайте одну суспензию раковых клеток, полученную от пациента, из опухолевой ткани с помощью набора для диссоциации опухоли. Начните с переноса примерно половины грамма опухолевой ткани в 100-миллиметровую чашку для клеточных культур, содержащую пять миллилитров буфера RPMI, дополненного ферментами. Затем с помощью ножниц и тканевых щипцов измельчите опухоль на мелкие кусочки размером от двух до четырех миллиметров.

Введите опухолевую смесь пипеткой в диссоциаторную пробирку и закройте пробирку. Переверните трубку, прикрепите к рукаву диссоциатор тканей и диссоциируйте ткань с помощью соответствующей программы. После диссоциации суспензию опухолевых клеток инкубировать на вращающемся штативе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Растирайте клеточную суспензию каждые 15 минут в течение инкубации. После инкубации переложите клеточную суспензию в новую коническую трубку объемом 50 миллилитров и добавьте 10 миллилитров RPMI. Затем центрифугируйте клеточную суспензию при 314 г в течение пяти минут.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость и суспензируйте гранулу в пяти миллилитрах РПМИ. Пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 40 микрон и соберите процеженный раствор в свежую пробирку объемом 50 миллилитров. После промывки сетчатого фильтра пятью миллилитрами среды RPMI центрифугируйте клеточную суспензию при 314 г в течение пяти минут, чтобы собрать гранулу.

Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем суспендируйте гранулу в RPMI до получения конечной концентрации четыре раза по 10 на пять ячеек на объем 10 микролитров. Переложите пять микролитров этой клеточной суспензии за одну инъекцию в свежую пробирку, и такой же объем матрицы базальной мембраны сделайте 10 микролитров клеточного раствора для каждой инъекции и поместите его на лед.

Перенесите мышь на платформу визуализации брюшной стороной вниз. Установите и закрепите носовой конус для поддержания изофлурановой анестезии. Начните процедуру имплантации с помощью лосьона для удаления волос и бритвы для депиляции спины и бока правильно обезболенной шести-восьминедельной мыши с дефицитом иммунитета NSG.

Нанесите на глаза животного оптическую мазь, чтобы предотвратить их высыхание. Затем закрепите мышь на месте, чтобы предотвратить любое непреднамеренное движение. Затем с помощью ультразвуковой визуализации определите мышиную печень, полую вену, селезенку, левую почку и прилегающий левый надпочечник.

Загрузите охлажденный шприц Гамильтона, оснащенный иглой малого диаметра, 10 микролитрами клеточного раствора. Затем, под ультразвуковым контролем, осторожно вводится охлаждаемый катетер 22-го калибра через кожу и мышцы спины непосредственно в левый надпочечник, чтобы обеспечить канал для клеточной инъекции. Извлеките иглу и оставьте катетер на месте.

Визуализация надпочечников на протяжении всего введения катетера, а также иглы и ее траектории крайне важна для обеспечения минимального повреждения окружающих структур и органов и снижения заболеваемости мышей. Затем проведите шприц через катетер, расположенный в центре надпочечника. Когда шприц проходит через катетер, важно сохранять стабильность катетера и следить за продвижением иглы.

Обратите внимание, что сама игла выступает примерно на два миллиметра за пределы катетера, ее положение легко видно на УЗИ. Введите клетки в целевую ткань надпочечников. Оставьте иглу на месте на одну-две минуты, чтобы матрица базальной мембраны застыла.

После того как матрикс базальной мембраны схватится, медленно извлекают иглу с последующим удалением катетера. Наконец, поместите мышь в клетку для восстановления до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине, прежде чем вернуться в домашнюю клетку. Ультразвуковая визуализация мониторит прогрессирование опухоли in vivo.

На этом изображении показано ультразвуковое изображение надпочечников через неделю после инъекции. Здесь люминесцентная визуализация мыши, которой была введена нейробластома через неделю после инъекции, показывает показания, не указывающие на приживление опухоли. Через две недели ультразвуковая визуализация показывает приживление опухоли и прогрессирование на площади примерно 40 квадратных миллиметров.

Биолюминесценция через две недели после инъекции показала излучение, составляющее 10 к седьмой, что свидетельствует о поглощении клетками и росте опухоли, коррелирующих с результатами ультразвукового исследования. Ультразвуковая визуализация через восемь недель после инъекции показала продолжающийся рост опухоли с площадью более 100 квадратных миллиметров. Опять же, биолюминесценция подтвердила результаты ультразвукового исследования с повышенным уровнем излучения от 10 до 9.

Трехмерная ультразвуковая визуализация опухоли показала объем более 100 кубических миллиметров, что является базовым уровнем, который наша лаборатория использует для начала доклинических терапевтических испытаний. Размер иссеченной опухоли значительно превышает один сантиметр, что коррелирует с ультразвуковыми измерениями и сигналами люминесценции. Этот носитель демонстрирует, как успешно установить ортотопические ксенографы надпочечников с клетками нейробластомы пациента с использованием ультразвукового контроля.

После освоения этой техники ее можно сделать менее чем за 12 минут за одну инъекцию, если она выполнена правильно.