Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

Общая цель этой процедуры заключается в получении изображений культивируемых цельных яичников, совместимых с автоматизированной количественной оценкой фолликулов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области репродуктивной биологии, например, как различные условия влияют на приспособленность яичников. Главное преимущество этой методики заключается в том, что она менее трудоемка и сохраняет трехмерную архитектуру органа.

Хотя этот метод был оптимизирован для культивируемых яичников мышей на пятый день после рождения, он также может быть применен к другим возрастным группам и тканям, таким как эмбриональные гонады или яички молодых мышей. Начните с чистой рабочей поверхности. Протрите десятипроцентным отбеливателем и дайте отбеливателю оставаться на поверхности рабочей зоны не менее пяти минут.

Через пять минут удалите излишки отбеливателя чистыми бумажными полотенцами и 70-процентным этанолом. Тщательно очистите микроскоп с 70-процентным содержанием этанола и положите на сцену сухое бумажное полотенце. Оберните чистые щипцы и ножницы бумажным полотенцем, смоченным в 70-процентном этаноле.

Затем вносят 50 миллилитров завязи питательной среды в коническую пробирку и подогревают на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. После того как среда прогреется, подготовьте планшеты и вкладыши, добавив сначала один миллилитр среды для культуры яичников в 35-миллиметровые планшеты для культуры тканей. Затем добавьте примерно 0,55 миллилитра среды в лунки 24-луночного планшета для культуры тканей и поместите вкладыш в каждую лунку, содержащую среду.

Следите за тем, чтобы мембраны соприкасались с носителем. Поместите 35-миллиметровые пластины и 24-луночную несущую пластину в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия, пятипроцентным углекислым газом и атмосферным кислородом. Затем поставьте горячую плиту рядом с областью для вскрытия и установите температуру на 37 градусов по Цельсию.

Если инкубатор для культивирования тканей не находится близко к зоне вскрытия, поместите одну из 35-миллиметровых чашек для культуры тканей, содержащую среду для культуры яичников, на горячую плиту. Затем начните вскрытие, распылив на только что усыпленную самку 70-процентный этанол и положив поверх сухого бумажного полотенца под микроскопом для вскрытия. Сделав разрез в брюшной полости, выдавите кишечник и расположите яичники.

Извлеките завязи и поместите их в питательную среду в 35-миллиметровой посуде. После того, как яичники будут рассечены, увеличьте увеличение с помощью диссекционного микроскопа, чтобы лучше визуализировать яичники и любые прикрепленные ткани. С помощью чистых щипцов с тонким кончиком удалите всю ткань, не относящуюся к яичникам, такую как бурса и жировая ткань, не повреждая яичники.

Затем поместите каждую пару яичников на предварительно замоченную вставку для клеточной культуры и отрегулируйте объем среды, чтобы убедиться, что он достаточен для поддержания влажности органа без его полного погружения. Поместите эксплантированные органы в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию, пятипроцентным углекислым газом и атмосферным кислородом. В желаемый момент времени эксперимента удалите питательную среду для яичников из планшета и зафиксируйте культивируемые яичники на вкладыше, покрыв ткань свежеприготовленным четырехпроцентным раствором PFA.

Заклейте края пластины парафиновой пленкой, чтобы избежать испарения, и поместите образцы при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Трижды промойте салфетку 70-процентным этанолом. Затем хранить в сцинтилляционных флаконах, наполненных 70-процентным этанолом при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшей обработки.

Начните окрашивание с удаления 70-процентного этанола из флаконов и промывки неподвижной ткани PBS при комнатной температуре с встряхиванием в течение как минимум четырех часов. После удаления ПБС добавьте достаточно раствора для пермеабилизации, чтобы полностью погрузить яичники. Поместите на орбитальный шейкер и выдерживайте при комнатной температуре в течение четырех часов.

Замените раствор для пермеабилизации достаточным количеством блокирующего раствора, чтобы полностью погрузить яичники. Затем инкубируйте запечатанные флаконы при комнатной температуре в течение минимум 12 часов на орбитальном шейкере. После блокировки поместите вкладыши в 24-луночный планшет и добавьте около 750 микролитров раствора первичного антитела, гарантируя, что яичники будут полностью погружены.

Затем поместите герметичную пластину на орбитальный шейкер и выдерживайте в течение четырех дней при комнатной температуре. Через четыре дня удалите первичные антитела и добавьте обильное количество раствора для умывания. Промойте яичники на ночь.

На следующий день замените свежим моющим раствором и выдержите на орбитальном шейкере в течение двух часов или более. После промываний добавьте вторичный раствор антител. Защитите образцы от света и инкубируйте на орбитальном шейкере при комнатной температуре в течение двух дней.

Через двое суток удалите из образцов вторичный раствор антител и добавьте раствор для промывки. Начните с приготовления раствора для очистки ScaleS0. Перемешайте раствор методом инверсии и выдержите при температуре 50 градусов Цельсия в течение 30 минут.

Дегазируйте очистительное решение ScaleS0. Затем удалите моющий раствор с иммуноокрашенных яичников. Добавьте раствор для очистки.

Накройте пластину алюминиевой фольгой и верните ее в орбитальный шейкер. Чрезвычайно важно быть терпеливым на этапах окрашивания и очистки. Как только ткань станет прозрачной, с помощью скальпеля с тонким концом осторожно удалите мембраны вставки, содержащие культивируемые яичники.

Поместите образец на предметное стекло и аккуратно накройте образец покровным стеклоподъемником. Затем приступайте к изображению образцов на микроскопе, способном выполнять оптический срез. На этом снимке показан яичник пятого дня после рождения, который не был очищен

Здесь завязь проявляется через час после добавления очищающего раствора. Яичник начнет становиться полупрозрачным в течение нескольких минут после погружения в очищающий раствор. Оптическое срезирование культивируемых яичников без очищения возможно, но клетки глубоко внутри ткани имеют сигнал, который трудно дифференцировать от фона, что препятствует правильному количественному определению ооцитов.

В отличие от этого, на этом репрезентативном изображении показан очищенный образец, в котором возможно количественное определение ооцитов по всему органу. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что антитела должны диффундировать по ткани; Таким образом, более толстые ткани потребуют более длительного времени инкубации. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как культивировать, окрашивать и визуализировать целые яичники.

В тексте описывается использование бесплатного программного обеспечения Fiji ImageJ, которое может быть использовано для простого количественного определения фолликулов. Не забывайте, что работа с параформальдегидом и азидом натрия может быть опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование вытяжных шкафов и средств индивидуальной защиты.