Инъекции липополисахарида в мышей, чтобы имитировать вход микробной производных продуктов после нарушения кишечного барьера

Общая цель этого эксперимента состоит в том, чтобы представить модель, которая имитирует поступление микробных продуктов после прорыва кишечного барьера. Эта модель может быть использована для исследования иммунных реакций после инвазии микроорганизмов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области воспалительных заболеваний кишечника, таких как неконтролируемое воспаление, которое характеризуется повышенной проницаемостью кишечного эпителия.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она не только использует определенный насос, но и является несложным подходом, не требующим хирургического вмешательства и может использоваться в любых лабораторных условиях. Демонстрировать процедуру буду я, Рэйчел Мак'Аньенго, постдок, и Берна Кайя, аспирантка. Обращайтесь с мышью аккуратно, но твердо, и удерживайте животное в одной руке.

Убедитесь, что мышь надежно удерживается и может нормально дышать. Слегка наклоните нос мыши к полу, чтобы обнажить брюшную полость для инъекции. Найдите среднюю линию живота и введите необходимый объем ЛПС в нижнюю левую или правую сторону.

Очень важно следить за тем, чтобы игла попала в брюшную полость, чтобы избежать ошибочных инъекций. Игла также не должна входить слишком глубоко в брюшную полость, чтобы избежать травмирования внутренних органов. Аккуратно верните животное в домашнюю клетку.

Наблюдайте за возникновением и тяжестью эндотоксемии у мышей в момент инъекции и каждые два часа после этого в течение восьми часов. Запишите наблюдения в прилагаемый оценочный лист. Подготовьте пробирки для сбора, добавив один миллилитр одноступенчатого реагента для выделения РНК в две миллилитровые пробирки, предварительно заполненные 1,4-миллиметровыми керамическими сферами.

После усыпления и обескровливания мыши с помощью ножниц разрежьте кожу и мышечный слой, обнажив брюшную полость с внутренними органами. Тщательно рассеките селезенку, печень и толстую кишку. Очистите от жира каждый орган, затем поместите в PBS на лед.

Далее с помощью ножниц или скальпеля отрежьте от каждого органа по кусочку длиной 0,5 сантиметра. Кратковременно высушите ткань на листе бумажной салфетки и поместите ее в пробирку для сбора, убедившись, что она полностью погружена в реагент для выделения РНК. Затем гомогенизируйте ткань в высокоскоростном настольном гомогенизаторе.

Для мягких тканей, таких как селезенка, печень и толстая кишка, используйте один цикл гомогенизации с высокой скоростью в течение 30 секунд. После гомогенизации инкубируйте образцы в течение пяти минут при комнатной температуре. Осторожно погрузите трубки в жидкий азот, чтобы быстро заморозить лизат тканей.

Храните замороженный лизат при температуре минус 80 градусов Цельсия до выделения РНК. Начните выделение РНК с размораживания замороженного лизата тканей на льду. После размораживания центрифугируйте образец при температуре 1000 G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы удалить оставшиеся частицы ткани, которые могут остаться.

После центрифугирования перенесите надосадочную жидкость в новую, безнуклеазную пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 200 микролитров ледяного хлороформа на один миллилитр реагента для выделения РНК. Немедленно встряхните хряще в течение 10-15 секунд. После инкубации образцов в течение двух-трех минут при комнатной температуре центрифугируйте при 12 000 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.

Теперь образец будет содержать три фазы: нижнюю фазу хлороформа красного фенола, интерфазу и верхнюю бесцветную водную фазу. Соберите РНК-содержащую верхнюю водную фазу и перенесите в новую, безнуклеазную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Чтобы осадить РНК, добавьте 0,5 миллилитра ледяного изопропанола на один миллилитр реагента для выделения РНК и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку пять-шесть раз.

После инкубации в течение 10-15 минут при комнатной температуре центрифугируйте при 12 000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования полностью удалите надосадочную жидкость, содержащую изопропанол, не потревожив гранулу. Затем промойте гранулы одним миллилитром ледяного 75%-ного этанола на один миллилитр реагента для выделения РНК, используемого для первоначального лизиса, и кратковременно обработайте образец вихрем.

После центрифугирования образца при 7500 или 12 000 умноженных на G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия полностью удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу. Оставьте открытые пробирки под химическим колпаком на три-пять минут, чтобы высушить гранулу РНК на воздухе при комнатной температуре. Затем растворите гранулу РНК в 20-50 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, тщательно пипетируя вверх и вниз.

Затем инкубируйте образец при температуре 55 градусов Цельсия в течение 10-15 минут для дальнейшего улучшения раствора РНК. Расщепляйте загрязняющую ДНК, сначала добавив воду без нуклеаз максимум к 10 микрограммам РНК, чтобы окончательный объем составил 50 микролитров после добавления буфера и фермента. Затем добавьте пять микролитров буфера 10X DNase 1 и один микролитр рекомбинантной DNase 1 на образец и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20-30 минут. После инкубации переведите ДНКазу в активационный реагент, затем добавьте пять микролитров в образец и хорошо перемешайте. Выдерживайте в течение пяти минут при комнатной температуре, периодически перемешивая вручную.

После центрифугирования при 10 000 G в течение полутора минут перенесите надосадочную жидкость, содержащую свободную от ДНК РНК, в новую безнуклеазную пробирку. Наконец, измерьте концентрацию и качество РНК с помощью спектрофотометра. После инъекции ЛПС оценка заболевания, которая включает в себя оценку внешнего вида и активности животных, открытия глаз, а также скорости и качества дыхания, была построена по оси Y в зависимости от времени по оси X.

ПЦР для количественной оценки экспрессии цитокинов показала, что пик IL6 достигал через два часа после введения ЛПС в селезенке и толстой кишке и через четыре часа после инъекции в печень. Экспрессия Il1 бета, Tnf альфа и Il10 достигла пика через четыре часа после инъекции во всех тканях. В течение восьми часов экспрессия Il6, Il1 beta, Tnf alpha и Il10 вернулась к исходному уровню.

При проведении процедуры важно помнить о необходимости учитывать дозу ЛПС, гигиеническое состояние мышей, момент окончания эксперимента и, самое главное, генетический фон штамма мышей. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как имитировать проникновение соединений бактериального происхождения в организм хозяина после прорыва барьера. Низкая, сублетальная доза ЛПС, систематически вводимая мышам, вызывает повышение регуляции провоспалительных цитокинов, которые количественно оцениваются с помощью ПЦР-анализа RGQ.