Протокол для приобретения дегенеративные Tenocyte от людей

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о биологии дегенеративных теноцитов человека, поскольку лишь немногие исследования подробно описали выделение и культуру дегенеративных теноцитов человека. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы можем получить дегенеративные теноциты человека без дополнительной травмы пациента, поскольку дегенеративная ткань приобретается во время стандартной операции по лечению эпикондилита. Демонстрировать процедуру будут д-р Су-Хонг Хан, Минджунг Пэк и Хён Кюн Ким из моего третьего уровня.

Чтобы получить образец ткани дегенеративных тендоцитов, с помощью хирургического скальпеля No 15 сделайте разрез кожи шириной от трех до пяти сантиметров прямо спереди медиально от латерального надмыщелка и проксимальнее уровня сустава, чтобы обнажить латеральный локоть и визуально расположить разгибатель лучевой кости в зоне апоневроза разгибателя. С помощью скальпеля сделайте расщепляющий разрез глубиной два-три миллиметра между длинным разгибателем запястья и апоневрозом разгибателя на границе раздела. После переднего втягивания длинного разгибателя лучевой кости локализованной ткани определите местонахождение патологической дегенеративной ткани по ее характерному тусклому сероватому цвету и, как правило, отечной и рыхлой ткани, и с помощью скальпеля и мини-лезвий осторожно, но резко резецируйте всю дегенеративную ткань.

Когда вся ткань будет собрана, закройте рану нерассасывающимся шовным материалом в соответствии со стандартными протоколами и осторожно удалите всю окружающую ткань из примерно одного кубического сантиметра образца ткани, поместив чистую ткань сухожилия в 10 миллилитров PBS, как только она будет обрезана. Затем зафиксируйте около половины собранной ткани в нейтральном буферном 10% формалине в химическом вытяжном шкафу на 12 часов. Чтобы создать теноцитарную культуру, перенесите вторую половину собранных контрольных и дегенерированных образцов тканей в отдельные чашки для культуры тканей, содержащие свежий PBS, и измельчите ткани на один кубический метр или более мелкие кусочки, переварите фрагменты ткани в 30 миллилитрах DMEM с добавлением 30 миллиграммов на миллилитр коллагеназы 2 на группу тканей при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

В конце разложения отфильтруйте клеточные растворы через отдельные клеточные фильтры размером 100 микрон и деактивируйте коллагеназу с помощью одного миллилитра FBS на пробирку. Соберите теноциты центрифугированием и повторно суспендируйте гранулы в соотношении от 10 до пятой клетки на 10 миллилитров DMEM с добавлением 10% FBS и 1% антибиотика, антимикотического раствора концентрации. Затем засейте клетки в одну 100-сантиметровую чашку для культивирования в каждом состоянии и культивируйте теноциты в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия и 5% углекислым газом в течение одной недели, меняя питательную среду каждые три дня до тех пор, пока не будет достигнуто 80%-ное слияние.

Для иммуноцитохимического анализа перенесите два раза по 10 в пятую клетку по 200 микролитров свежей среды в каждую лунку одного предметного стекла с восемью лунками на опытную группу и выращивайте клетки до слияния в течение 24 часов. На следующий день промойте клетки PBS с последующей фиксацией 500 микролитрами 4%-ного формальдегида на лунку и пермеабилизацией 0,5%-ным тритоном Х 100 в PBS в течение 10 минут. Чтобы блокировать любое неспецифическое связывание, инкубируйте клетки с 1% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% Tween 20 в PBS, в зависимости от экспериментальной целесообразности, с последующей инкубацией с флуоресцентно помеченными первичными антителами, представляющими интерес, при четырех градусах Цельсия в течение ночи, защищенной от света.

На следующее утро пометьте клетки соответствующими вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света, и нанесите на образцы 0,5 микролитра подходящей флуоресцентной рабочей среды на камеру. Затем визуализируйте образцы на флуоресцентном микроскопе с 400-кратным объективом. Для патологического анализа ткани встраивают формальный и фиксированный контрольные и дегенерированные образцы сухожильной ткани в четыре-пять миллилитров парафина и получают срезы от четырех до пяти микрон из каждого парафинового блока.

Для гематоксилина в эозине или окрашивания H&E депарафинизируйте образцы с помощью трех пятиминутных погружений в ксилол с последующей гидратацией с помощью градуированных погружений этанола и двухминутной промывки водой из-под крана. Затем пометьте образцы гематоксилином на пять минут, после чего еще раз промывайте водой еще две минуты. Опустите промытые образцы в 1% соляной кислоты и 70% этанола на три секунды, после чего промывайте водой в течение трех минут.

Нейтрализуйте кислоту 10-секундным погружением в 0,5% аммиака, после чего еще раз промыть водой три минуты. Пометьте нейтрализованные образцы эозином в течение пяти минут и обезвожьте окрашенные H&E образцы с помощью погружений в дифференцированный этанол. После трех погружений в ксилол закрепите образцы с помощью соответствующего монтажного носителя и защитного стекла.

Для проведения иммуногистохимического анализа образцов тканей используется набор для детектирования бондполимера в соответствии с инструкцией производителя со следующими незначительными доработками. После депарафинизации ксилолом, как показано на рисунке, погрузите образцы в раствор для извлечения эпитопа связи на 30 минут при температуре 100 градусов Цельсия для извлечения антигена, после чего последует пятиминутная инкубация в перекиси водорода для гашения любой эндогенной пероксидазы. Затем пометьте срезы на пятнадцать минут при комнатной температуре первичными антителами, представляющими интерес.

В конце инкубации пометьте образцы соответствующей системой конъюгата полимерного линкера пероксидазы хрена, не содержащего биотина, в течение 50 минут при комнатной температуре. Затем установите срезы с помощью защитного стекла в соответствующую монтажную среду и визуализируйте образцы на световом микроскопе с 400-кратным увеличением. Анализ H&E показывает, что ткань, собранная из дегенерированного латерального эпикондилита, демонстрирует дезорганизованные коллагеновые пучки с потерей полярности и тонкие, прямые, сильно упакованные параллельные волоконные структуры.

Действительно, коллагеновые пучки положительны на окрашивание Alcian Blue в дегенерированных участках ткани, что указывает на повышенное присутствие протеогликана и гликозаминогликана в поврежденной ткани. Иммуногистохимический анализ дегенерированных сухожилий также указывает на цитоплазматическую гранулярную положительную реакцию на фактор роста эндотелия сосудов, которая не наблюдается в контрольных образцах здоровой ткани сухожилия. Оба типа культивируемых образцов тканей могут быть подтверждены как теноциты с помощью иммунофторхимии, при этом большинство культивируемых клеток экспрессируют репрезентативные теноцитарные маркеры, такие как белки ирокез и теномодулин, и демонстрируют удлиненный вид.

Следует отметить, что дегенеративные теноциты также демонстрируют более высокую скорость пролиферации в культуре по сравнению с теноцитами, полученными от здоровых контрольных групп, а также более высокую экспрессию нескольких генов, которые, как известно, связаны с развитием тендинопатии. В заключение, этот валидированный протокол с использованием дегенеративных теноцитов прокладывает путь для будущих исследований в области биологии сухожилий и для тестирования новых вмешательств.