Новый метод доставки ДНК плазмиды мыши Уротелий мочевого пузыря путем электропорации
3 мая 2018 г.
Мы опишем новый метод для доставки плазмида ДНК в клетки мыши мочевого пузыря в естественных условиях через катетеризация уретры и электропорации urothelial. Она предлагает быстрый и удобный способ для генерации автохтонные мыши модели заболеваний мочевого пузыря.
Общая цель этого метода заключается в доставке плазмид ДНК в уротелий мочевого пузыря живых мышей in vivo для сверхэкспрессии генов или редактирования генома. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области рака мочевого пузыря, например, как различные генетические мутации способствуют прогрессированию рака мочевого пузыря? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает быстрый и удобный способ доставки генов в мочевой пузырь без проблем безопасности и технических барьеров, связанных с вирусными векторами.
Сначала у меня появилась идея использовать любые сконструированные ассоциированные вирусы для доставки ДНК, но это не очень хорошо работало в мочевом пузыре. Применение этого метода также может распространяться на генную терапию, поскольку электропорация может обеспечить эффективную доставку ДНК-плазмид в уротелиальные клетки. Демонстрировать процедуру будут Офир Стефансон и Юэли Лю из моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, отавтоклавируйте все хирургические инструменты и простерилизуйте рабочее место с помощью 70% этанола. Часто распыляйте на хирургические инструменты и перчатки 70% этанол при выполнении последующих процедур для поддержания стерильных условий. Для начала сделайте мышь под наркозом и побрейте операционную область.
Чтобы истощить мочу, нанесите смазку на катетер и убедитесь, что его внешняя поверхность полностью покрыта. Затем вставьте катетер в отверстие мочеиспускательного канала мыши и медленно надавите на него, пока он не достигнет мочевого пузыря. Мягко надавите на живот, чтобы помочь истощению мочи.
Затем слейте мочу с помощью пипетки в стакан для отходов, затем введите 80 микролитров PBS в наружный конец катетера, а другой конец все еще находится в мочевом пузыре. Далее аккуратно приложите к катетеру шприц толщиной в один миллиметр. Осторожно надавите на шприц, чтобы ввести PBS в мочевой пузырь.
Оставьте некоторое количество PBS в катетере, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в мочевом пузыре. После этого извлеките шприц и подождите, пока PBS выйдет из мочевого пузыря. Осторожно надавите на брюшную полость, чтобы опорожнить PBS, затем выбросьте PBS из катетера с помощью пипетки в стакан для отходов.
Повторите стирку PBS еще два раза. Для каждого мочевого пузыря для трансфекции необходимо подготовить не менее 20 микролитров ДНК-плазмиды в концентрации один микрограмм на микролитр. Далее добавьте один микролитр трипанового синего в 20 микролитров раствора плазмиды и 1,5 миллилитровую микроцентрифужную пробирку и пипетку, чтобы хорошо перемешать.
Чтобы доставить плазмиду, нанесите 70% этанол на брюшную полость. Сделайте вертикальный разрез в один сантиметр, чтобы открыть кожу живота над мочевым пузырем. Далее разрежьте мышечный слой, чтобы обнажить мочевой пузырь.
Нанесите пипеткой не менее 20 микролитров плазмиды плюс раствор трипанового синего в наружный конец катетера и отсоедините его от шприца. Затем введите раствор плазмиды в мочевой пузырь. Если мочевой пузырь посинел, инъекция прошла успешно.
Оставьте немного жидкости в катетере, чтобы избежать образования пузырьков воздуха в мочевом пузыре. После этого возьмитесь за наружное отверстие уретры и извлеките катетер и шприц. С помощью шнура затяните наружное отверстие уретры.
Сделайте две петли с бечевкой, а затем завяжите двумя узлами. Это ответственный шаг, который требует сотрудничества двух людей. Убедитесь, что узлы плотно затянуты, чтобы плазмиды не вытекли наружу.
Теперь включите генератор электропорации. Зажмите мочевой пузырь двумя электродами и нажмите на ножную педаль, чтобы выполнить электропорацию. Чтобы сохранить мочевой пузырь в тонусе, можно зажать заднюю часть брюшного разреза пинцетом.
Избегайте любого контакта между пинцетом и электродами, так как это может привести к образованию искры. Когда это будет сделано, зашите брюшную полость и кожное отверстие стерильным хирургическим швом. Снимите веревку и прикрепите зажимы.
Нанесите йод на рану, а затем извлеките животное из системы изофлурана. Вводите анальгетик бупренорфином подкожно для облегчения послеоперационной боли. Держите животное на грелке и верните его в домашнюю клетку после полного выздоровления.
Проверяйте животное не реже одного раза в день на предмет нормальной подвижности, питья и пищевого поведения, а также отсутствия признаков инфекции до тех пор, пока разрез не заживет. Затем, через неделю, снимите зажимы. Проводите последующие инъекции анальгетика бупренорфином, если животное проявляет болевые симптомы, такие как снижение груминга, повышенная агрессивность и вокализация.
Чтобы продемонстрировать успешную доставку генов в уротелий мочевого пузыря, через мочеиспускательный канал вводили 20 микролитров плазмиды pCAG-GFP и раствора трипанового синего и вводили пять электрических импульсов. Здесь показана успешная электропорация, при которой мочевой пузырь стал зеленым через 48 часов, в то время как отрицательный контрольный мочевой пузырь, который не подвергался электропорации, не показал сигнала GFP. Иммунофлуоресцентное окрашивание разрезанных тканей мочевого пузыря проводили антителами к CK5, CK18 и GFP.
Наблюдалось присутствие сигнала GFP в зонтичных, промежуточных и базальных клетках, но не в мышечном слое, что указывает на хорошую специфичность доставки плазмид в уротелий. После освоения этой техники ее можно выполнить за 15 минут при правильном выполнении. После своего развития этот метод открывает путь исследователям в области рака мочевого пузыря к созданию новых автохтонных мышиных моделей для изучения механизмов прогрессирования заболевания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается новый метод доставки плазмид ДНК в клетки уротелия мочевого пузыря мыши in vivo посредством катетеризации уретры и электропорации. Эта методика представляет собой быстрый и удобный способ создания автохтонных мышиных моделей заболеваний мочевого пузыря.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генная терапия
- Исследование рака мочевого пузыря
- Методы электропорации
Теоретические сведения
- Метод направлен на доставку плазмид ДНК в уротелий мочевого пузыря живых мышей.
- Он позволяет ответить на ключевые вопросы о прогрессировании рака мочевого пузыря.
- Традиционные вирусные векторы создают проблемы с безопасностью и технические барьеры.
- Данный метод представляет собой альтернативный способ доставки генов.
Цель исследования
- Для облегчения гиперэкспрессии генов или редактирования генома в клетках мочевого пузыря.
- Для изучения влияния генетических мутаций на рак мочевого пузыря.
- Для повышения эффективности методов доставки ДНК.
Используемые методы
- Катетеризация уретры для доставки плазмид.
- Электропорация для усиления поглощения ДНК.
- Применение in vivo на моделях мышей.
- Демонстрация Офира Стефансона и Юэли Лю.
Основные результаты
- Успешная доставка ДНК-плазмид в клетки уротелия.
- Быстрый и эффективный метод по сравнению с вирусными векторами.
- Потенциальные области применения в генной терапии и исследованиях рака.
- Подтвержденная осуществимость на моделях живых мышей.
Выводы
- Данный метод представляет собой новый подход к доставке генов в мочевой пузырь.
- Он имеет важное значение для изучения заболеваний и рака мочевого пузыря.
- Дальнейшие исследования могут расширить возможности его применения в генной терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическое значение для отрасли
Данный метод устраняет критический пробел в исследованиях рака мочевого пузыря, обеспечивая быструю невирусную доставку генов в уротелий in vivo. Он способствует валидации мишеней и снижению рисков при изучении механизмов за счет возможности транзиторной сверхэкспрессии или нокдауна генов-кандидатов в системе, релевантной данному заболеванию. Такой подход ускоряет создание доклинических моделей, сокращая временные и финансовые затраты по сравнению с моделями на основе герминальных мутаций, при этом сохраняя физиологическую релевантность для трансляционных исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы путем доставки плазмид в клетки уротелия мочевого пузыря для функциональной модуляции генов.
- Практическая ценность: Представляет собой быструю и удобную альтернативу вирусным векторам, позволяя избежать ограничений по биобезопасности и задержек в производстве.
- Прогностическая ценность: Обеспечивает возможность фенотипического скрининга в контексте нативной ткани, что повышает достоверность выбора мишеней для путей развития рака мочевого пузыря.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать воспроизводимые, количественно измеримые результаты (например, экспрессию GFP) для оценки эффективности трансфекции и уровней экспрессии генов.
- Практическая ценность: Стандартизирует доставку плазмид посредством катетеризации и электропорации, что обеспечивает согласованность при скрининге генетических или химических воздействий.
- Масштабируемость: Облегчает подготовку валидированных моделей мочевого пузыря для последующего анализа биомаркеров или ответа на лекарственные препараты.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Создание автохтонных мышиных моделей, отражающих механизмы инициации и прогрессирования рака мочевого пузыря.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность индуцибельной модуляции генов у взрослых мышей, что позволяет осуществлять временной контроль в доклинических исследованиях.
- Трансляционная преемственность: Связывает результаты фундаментальных исследований с доклинической валидацией путем тестирования генетических эффектов в клинически значимой системе органов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая быструю итерацию от гипотезы о мишени до валидации in vivo в тканях мочевого пузыря.
- Биология открытий: способствует выяснению механизмов сигнальных путей и подтверждению мишеней посредством прямой доставки генов в отделы уротелия.
- Скрининг: обеспечивает количественные данные флуоресценции или иммуногистохимического анализа для оценки эффективности трансфекции и модуляции генов.
- Аналитика: предоставляет измеримые конечные точки (например, интенсивность сигнала GFP, специфичность к типу клеток) для сравнения экспериментальных условий.
- Трансляционные исследования: позволяет создавать доклинические модели фенотипов рака мочевого пузыря с использованием генетически модифицированного уротелия.
- Прикладное использование: создает многократно используемую платформу для доставки генов для различных мишеней и исследований в области урологических заболеваний.
Операционное и организационное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозирования при валидации мишеней за счет снижения зависимости от систем искусственной гиперэкспрессии.
- Практическая ценность: повышает воспроизводимость за счет стандартизации параметров хирургического вмешательства и электропорации.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала за счет ускорения создания моделей и снижения потерь из-за неправильного выбора мишеней.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней при раке мочевого пузыря с учетом рисков на основе функциональных данных in vivo.
Особенности реализации
- Требуются навыки проведения хирургических операций на мышах, катетеризации и электропорации.
- Необходимы стерильные хирургические инструменты, генератор для электропорации и совместимые электроды.
- Требуется стандартизация действий всех членов команды для обеспечения постоянства объема плазмиды, параметров импульса и степени обнажения мочевого пузыря.
- При адаптации метода следует учитывать размер плазмиды, выбор промотора и скорость обновления уротелия, которые влияют на продолжительность экспрессии.
- Практические ограничения включают транзиторный характер экспрессии (пик через 48 часов) и технические сложности при сохранении целостности мочевого пузыря во время процедур.
