Изоляции нижнечелюстной железы водохранилище содержимого из Bornean ' взрывающаяся муравьи (Formicidae) для анализа Volatilome GC-MS и MetaboliteDetector

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы метаболомики насекомых. Подход к профилированию метаболитов может быть использован для изучения химической экологии муравьев путем выяснения роли летучих веществ во взаимодействии с другими организмами. Основным преимуществом представленного рабочего процесса является то, что он состоит из двух отдельных частей, которые в принципе могут применяться независимо друг от друга.

Во-первых, физическая изоляция резервуара нижней челюсти и его содержимого, а во-вторых, нецеленаправленное профилирование и идентификация летучих органических компонентов в представляющем интерес биологическом образце. Демонстрировать процедуру будет Михаэла Хёнигсбергер, талантливый аспирант из моей лаборатории. Перед вскрытием муравьев в вытяжном шкафу очистите стеклянную чашку Петри и инструменты для препарирования бумажными салфетками и смесью метанола и воды один плюс один по объему.

Храните блюдо при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Затем возьмите массу 1,5 миллилитровых флаконов с короткой резьбой, включая их завинчивающиеся крышки, которые содержат кремниевый ПТФЭ Septa. Храните флаконы на льду.

Затем поместите замороженный податливый холодный пакет в коробку из пенополистирола. Затем загрузите чашку Петри поверх холодного пакета и положите в нее замороженного муравья. Теперь рассмотрим муравья с помощью стереомикроскопа.

Проверьте целостность его желудочных отсеков. У муравья должна быть неповрежденная гастерная область. Не используйте муравьи с плоскими гастерами или следами затвердевшего резервуара нижнечелюстной железы на поверхности их тела.

Теперь изолируйте содержимое резервуара нижней челюсти от муравья. С помощью щипцов захватите подиум и черешок, затем осторожно раздвиньте эти сегменты тела. Далее возьмитесь за гастер на четвертом тергите с помощью тонких щипцов.

С помощью другой пары щипцов возьмите один тергит и аккуратно удалите тергит, отклеив его. Повторите этот процесс, чтобы оторвать второй и третий тергиты, чтобы желудочно-кишечная часть резервуаров нижней челюсти была наиболее заметна. Резервуары нижнечелюстной железы имеют желтый цвет у рабочих муравьев C.Explodens, но цвет может варьироваться от белого на желтом до красного у других видов.

Далее с помощью иглы для рассечения аккуратно удалите воскоподобное содержимое парных резервуаров нижнечелюстной железы, выцарапав их из желудочного отсека. Удаляйте только те части содержимого резервуара нижней челюсти, которые можно изолировать, не оказывая давления на другие железы и структуры тела, присутствующие у муравьиного гастера. Нет необходимости собирать все содержимое резервуара нижней челюсти.

Теперь соберите содержимое резервуара нижней челюсти, осторожно касаясь его кончиком иглы для вскрытия, пока оно не прилипнет к нему. Затем переложите содержимое железы в холодный флакон объемом 1,5 миллилитра с короткой нитью. Может потребоваться переместить кончик иглы вдоль стенки флакона и размазать содержимое железы по стенке флакона.

Держите коллекцию накрытой и на льду до тех пор, пока ее не можно будет проанализировать. Между вскрытиями повторно очистите инструменты и чашку смесью метанола и воды. Чтобы сделать одну аналитическую пробу, объедините содержимое резервуаров желез нескольких муравьев.

В этом случае содержимое железы от пяти рабочих муравьев C.explodens объединяется. Для контроля соберите образцы, состоящие из железы Дюфура, которая примыкает к резервуарам нижней челюсти. Перед извлечением железистого содержимого определите массы аналитических образцов.

Затем добавьте 14 частей ледяного этилацетата высокой чистоты по объему, к одной части ткани по массе. Вортейте препарат в течение пяти минут в остывших условиях. Далее центрифугируйте образцы в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость.

Ожидается от 55 до 75 микролитров надосадочной жидкости из образца из пяти муравьев. Переложите каждую надосадочную жидкость в предварительно охлажденный флакон с короткой нитью объемом 1,5 мл с микровкладышем объемом 0,1 мл и плотно запечатайте флаконы с помощью завинчивающихся крышек с отверстиями и перегородками из красной резины из ПТФЭ. Для полной последовательности измерений GCMS приготовьте флакон с короткой нитью объемом 1,5 мл с калибровочной смесью с индексом удержания, изготовленный путем разбавления коммерчески доступных стандартных растворов алканов в гексане до восьми миллиграммов на миллилитр на соединение.

Затем приготовьте еще один флакон с чистым этилацетатом, который будет служить в качестве заготовки растворителя. На охлаждаемый лоток автосамплера газового хроматографа загрузите сначала заготовку растворителя, во-вторых, калибрующую смесь с индексом удержания, в-третьих, экстракт содержимого резервуара нижней челюсти и, в-четвертых, экстракт содержимого желез Дюфура. Положите образцы с лотком на лед для транспортировки к газовому хроматографу.

Вставьте лоток в охлажденный автосамплер. Для каждого образца вводят один микролитр аликвата в масс-спектрометр ГХ для хроматографической сепарации на колонке, подходящей для целевых соединений. Например, столбец пользовательского интерфейса HP-5MS.

Далее задайте соответствующие параметры GC. Например, использовать гелий на газе-носителе с постоянным потоком столба один миллилитр в минуту. Используйте нарастание температуры духовки, начиная с 40 градусов по Цельсию в течение двух минут, а затем с 10 градусов по Цельсию в минуту до 330 градусов по Цельсию.

Затем следует семиминутное удержание. С этими параметрами установите температуру на входе 270 градусов по Цельсию. Теперь, при необходимости, отрегулируйте коэффициенты разделения для масс-спецификации GC.

впрыскиваются таким образом, чтобы они обеспечивали адекватную форму пиков и интенсивность для интересующих соединений. Установите вспомогательную температуру на 350 градусов по Цельсию. Для массового спека.

Используйте следующие параметры. Температура источника рассеянного склероза составляет 230 градусов по Цельсию, четырехкратная температура рассеянного склероза равна 150 градусам Цельсия, диапазон сканирования от 30 до 500 градусов массы, что приводит к скорости сканирования около трех сканирований в секунду. И задержка растворителя в 4,1 минуты для заготовки растворителя и экспериментальных образцов, или задержка растворителя в 6,1 минуты для калибровочной смеси с индексом удержания.

Когда измерения будут завершены, откройте программное обеспечение для анализа данных GCMS и экспортируйте данные в виде файла проекта AIA на портативное запоминающее устройство, чтобы облегчить передачу данных на компьютер с 64-разрядной операционной системой на базе Linux. Для анализа данных следуйте текстовому описанию протокола использования программного обеспечения для детектора метаболитов. В полевых условиях муравьев собирали и замораживали при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение двух дней, а затем хранили при температуре минус 80 градусов по Цельсию до тех пор, пока их не анализировали.

Содержимое резервуара нижнечелюстной железы пяти рабочих муравьев C.explodens было объединено и измерено с помощью GCMS. Анализ данных выявил десятки предполагаемых соединений, содержащих железы. Два доминирующих метаболита в экстракте резервуара нижнечелюстной железы вызывают перегрузку колонки.

Именно поэтому тот же образец был проанализирован еще раз с более высоким соотношением разделения 50 к одному. Перекрестное загрязнение содержимого резервуара нижней челюсти по составу железы Дюфура было исследовано путем изучения образцов железы Дюфура. Такие загрязнители демонстрировали позднее время удержания, начиная примерно с 29 минут.

Обнаруженные предполагаемые метаболиты содержимого резервуаров нижней челюсти были идентифицированы на основе комбинации спектра и индекса удержания, схожих с собственной библиотекой. Таким образом, удалось подтвердить идентичность около 10% обнаруженных метаболитов, некоторые из которых перечислены как соединения от первого до пяти. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять, извлекать и определять, по одному метаболиту, выбирая измерение МС.

После освоения выделение, экстракция растворителем и получение данных одного и того же образца могут быть выполнены примерно за два часа, если они выполнены правильно. В зависимости от сложности профиля летучих органических соединений время, необходимое для оценки данных, может варьироваться. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что образец должен постоянно охлаждаться с момента сбора до анализа.

Кроме того, перед разделом необходимо убедиться, что гастер муравья физически цел. Эта процедура также может быть объединена со сравнительным или абсолютным количественным определением метаболитов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как метаболический состав и различные условия окружающей среды, или абсолютные количества консервированной составляющей. Удобно отметить, что этапы экстракции, измерения и оценки данных этого протокола также могут быть применены к нескольким биологическим системам, таким как другие насекомые, микроорганизмы или растения.