Характеристика гликопротеины с складке иммуноглобулина рентгеноструктурного анализа и биофизических методов

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гликопротеинов. Дает представление о функции белка, роли N-связанных гликанов, а также о механизме и действии антибиотиков, нацеленных на гликопротеин. Основное преимущество данной методики заключается в том, что ее можно применять к любому интересующему гликопротеину.

Облегчение структурной и биофизической характеристики широкого спектра гликопротеиновых мишеней. Демонстрировать эту процедуру будет Хун Цуй, координатор исследовательского проекта в нашей лаборатории. Для начала подготовьте и трансфектируйте клетки, как указано в текстовом протоколе.

Соберите клетки центрифугированием при 6, 371 g и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Оставьте надосадочную жидкость, а затем используйте фильтр 0,22 микрона для ее фильтрации. Загрузите отфильтрованную надосадочную жидкость со скоростью четыре миллилитра в минуту на колонку Ni-NTA в настольной хроматографической системе.

После этого промыть колонку тремя-четырьмя объемами промывочного буфера. Разведите очищенный гликопротеин из колонки с помощью градиента элюирующего буфера, собирая при этом фракции. Вытяните фракции, содержащие ускользающий пик, в центробежном фильтрационном устройстве с предельной номинальной молекулярной массой 10 килодальтон.

Затем сконцентрируйте путем центрифугирования при 4000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут или до тех пор, пока образец не достигнет объема 500 микролитров. Введите концентрированный гликопротеин в петлю для образца объемом 500 микролитров. Загрузите гликопротеин в предварительно уравновешенную высокопроизводительную колонку исключения размера в системе FPLC при температуре четыре градуса Цельсия во время сбора фракций.

Используя центробежное фильтрующее устройство с номинальным пределом молекулярной массы 10 килодальтон, сконцентрируйте чистый дегликозилированный ECD в 4 000 раз G и четырех градусах Цельсия до тех пор, пока не будет получена желаемая концентрация. После определения концентрации белка центрифугируйте образец при температуре 12 000 G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы удалить пыль и другие загрязнения.

Затем добавьте 80 микролитров кристаллизационного раствора из коммерческого кристаллизационного экрана в каждую скважину-резервуар в 96-луночной кристаллизационной пластине. Используйте кристаллизационного робота для дозирования капель белка в лунки кристаллизационной пластины. Использование общего объема капель 200 нанолитров при соотношении очищенного белка к кристаллизационному раствору один к одному.

После этого заклеиваем пластину скотчем. Перенесите пломбированную пластину в пластину тепловизора для осмотра в видимом и ультрафиолетовом свете. Определите условия, которые дают исходные кристаллические головки гликопротеина, и дополнительно оптимизируйте эти кристаллы, как описано в текстовом протоколе.

Криозащитите кристаллы, замочив их в растворе маточного раствора с добавлением 20% глицерина. Затем установите кристаллы в CryoLoops. Используя жидкий азот, мгновенной заморозкой смонтированные кристаллы перед сбором данных.

После получения хорошо дифракционных кристаллов в 24-луночной кристаллизационной пластине приготовьте стоковый раствор из 50 ммиланярного лиганда и 20 ммиланярного триса при pH 9,0 со 150 ммиллярами хлорида натрия. Добавьте раствор этого лиганда в различных концентрациях к заранее приготовленной капле, содержащей кристаллы ECD. Запечатайте каплю на время инкубации от пяти минут до пяти дней.

Используя световой микроскоп, визуально отслеживайте кристаллы, чтобы выявить любые возможные изменения морфологии. После инкубации кристаллы монтируют с помощью CryoLoops и криозащищают их в растворе маточного раствора с добавлением 20% глицерина. Чтобы начать биослойную интерферометрию, приготовьте 50 миллиметров 1X Kinetics Buffer из 10X Kinetics Buffer, как указано в текстовом протоколе.

Добавьте 200 микролитров этого буфера в предварительно смачиваемую пластину. Перенесите шесть биосенсоров Ni-NTA в планшет и дайте им увлажниться в буфере в течение 10 минут. Затем разведите ECD с мечкой His, в одном миллилитре 1X Kinetics Buffer с конечной концентрацией 25 нанограммов на микролитр.

И готовить серийные разведения очищенного ФАБа. Теперь поместите реагенты в 96-луночный микропланшет, как показано здесь. Где B представляет 1X кинетический буфер, L представляет загрузку гликопротеинов, помеченных His, числовые записи представляют концентрации разбавленных FAB, а R представляет буфер регенерации.

Перенесите гидратированные биосенсоры в лунки, содержащие 1X Kinetics Buffer, на 60 секунд, чтобы они были базовыми. Затем загрузите гликопротеин в концентрации 25 нанограммов на микролитр в течение 240 секунд при 1000 оборотах в минуту. Поместите биосенсоры обратно в лунки, содержащие 1X Kinetics Buffer, на 60 секунд для второго базового уровня.

Перенесите датчики в лунки, содержащие серийные разведения FAB, на 180 секунд. После этой фазы ассоциации перенесите биосенсоры обратно в 1X Kinetics Buffer для 180-секундного этапа диссоциации. Затем откройте программное обеспечение для анализа.

На первой вкладке импортируйте и выберите данные. На второй вкладке на первом шаге выбор данных выберите выбор датчика. Выделите опорные ямки, затем щелкните правой кнопкой мыши, чтобы установить опорную яму.

На втором шаге, вычитание, выберите опорные скважины. После этого на третьем шаге выровняйте ось Y, выберите базовую линию и установите временной диапазон от 0,1 секунды до 59,8 секунды. На четвертом шаге выберите межступенчатую коррекцию и выровняйте по диссоциации.

Затем на пятом шаге обработайте фильтрацию по Савицкому-Голе и нажмите на обработку данных. Ворота на третью вкладку. На втором шаге анализа с помощью модели «один к одному» выберите ассоциацию и диссоциацию, выберите глобальную подгонку и сгруппируйте по цвету.

Щелкните правой кнопкой мыши по кривым, выберите «Задать цвет» и установите для всех кривых нужные цвета. После этого выберите подходящие кривые. Если данные хорошо подогнаны, экспортируйте результат, нажав кнопку Сохранить отчет.

Повторите эксперимент для всех желаемых условий. В этом исследовании несколько конструкций внеклеточного домена CD22 были успешно клонированы в вектор экспрессии pHL-sec. Затем эти конструкции чрезмерно экспрессируются в клеточных линиях HEK293-F и HEK293-S млекопитающих.

В то время как культуры, содержащие примерно один миллион полтора миллиона клеток на миллилитр, экспрессировали очень похожие уровни гликопротеинов. Культуры всего полумиллиона клеток на миллилитр экспрессировали заметно меньше. После этого культуры собирают и выделяют гликопротеин ECD с помощью аффинной и эксклюзионной хроматографии для очистки всех конструкций до однородности размера.

Получение высокочистого образца для кристаллизации и биофизических исследований. После этих процедур могут быть выполнены другие методы, такие как электронная микроскопия одиночных частиц, чтобы ответить на дополнительные вопросы о трехмерной структуре полноразмерного внеклеточного домена или белковых комплексов. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как экспрессировать, очищать, структурно и биофизически характеризовать гликопротеины, их лиганды и антитела-мишени.