Визуализация микробиоты в кишки клеща в целом гора в Situ гибридизация

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы энтомологии клещей, такие как оценка присутствия жизнеспособных бактерий в клеще в пространстве и времени. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он не требует секционирования клещей или дорогостоящего оборудования, а также позволяет пространственно и временно визуализировать транскрипты генов. Как правило, люди, плохо знакомые с этой техникой, будут испытывать трудности, потому что она включает в себя несколько этапов и реагентов.

Однако эта методика не является трудоемкой. Хотя это может занять около трех дней, время работы составляет всего несколько часов каждый день. При подготовке кормите собранных клещей за 48-72 часа до сбора кишок.

Чтобы вскрыть кишку от клеща, добавьте от 20 до 30 микролитров раствора MEMFA в чистое предметное стекло. Затем поместите клеща в MEMPA и настройте фокус на голове клеща. Теперь с помощью пары стерильных бритвенных лезвий из высокоуглеродистой стали отрежьте область головы в области скутума, оставив тело клеща в целости.

Далее аккуратно надавите на тело, чтобы вытолкнуть кишечник, дивертикулы и слюнные железы из кутикулы тела. Затем, не повреждая кишки, аккуратно отделите их от слюнных желез и аккуратно зачерпните порезы лезвием бритвы. Соберите все собранные кишки в 1,5-миллилитровую пробирку с 500 микрометрами MEMFA.

Затем инкубируйте трубку при комнатной температуре с легким покачиванием в течение одного часа. На следующий день обезвожьте ткань, как указано в текстовом протоколе, и храните ее при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Чтобы приготовить сетчатую корзину, сначала используйте нагретое лезвие с одним краем на скальпеле, чтобы отрезать дно от двухмиллилитровой или пятимиллилитровой центрифужной пробирки с защелкивающейся крышкой.

Возможно, потребуется несколько раз нагреть лезвие, прежде чем резка будет завершена. Далее вырежьте квадрат из нейлоновой сетки 110 микрон, который немного больше новых отверстий. Затем приклейте сетку к отверстию, слегка вдавливая трубку в сетку на конфорке, установленной на средний/слабый огонь, пока не получится хороший шил.

После того, как он остынет, обрежьте лишнюю сетку, и следите за тем, чтобы не было зазоров. Сделайте 24 такие корзины, чтобы они соответствовали 24-луночной тарелке. Затем прорежьте отверстия в крышке 24-луночной пластины таким образом, чтобы кромка корзины для образцов захватывала отверстие и не проваливалась внутрь.

По завершении собранные корзины для образцов должны полностью погрузиться в лунки. Теперь используйте этот встроенный держатель для переноса корзин с одной тарелки на другую с относительной легкостью на протяжении всей гибридизации in situ. Используйте две такие тарелки, чтобы пока образец инкубируется в одной, другая могла подготовиться к следующей промывке.

В этом разделе рассматриваются некоторые этапы гибридизации in situ. Полное описание см. в текстовом протоколе. Для начала перенесите каждый фиксированный образец ткани в корзину с маркированными образцами.

Организуйте пластину в соответствии с условиями эксперимента и окрашивайте не менее пяти кишок в каждом условии. Во-первых, аккуратно увлажните образцы. Избегайте появления пузырьков воздуха, постепенно увеличивая соотношение PBS-T и этанола при каждой стирке.

В течение первого дня, после двухчасового этапа предварительной гибридизации, вместо того, чтобы выбрасывать буфер для гибридизации, сохраните его для дальнейшего использования во время анализа. В дальнейшем, при обработке образцов зондовым гибридизационным раствором, плотно накрыть пластину алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить испарение раствора. На второй день загрузите зарезервированный буфер для гибридизации в 24-луночную пластину, и прогрейте пластину до 60 градусов Цельсия.

Позже в тот же день, чтобы удалить все следы зонда и гибридизационного буфера, дважды промойте образцы 2x SSC в течение трех минут за промывку. Затем промойте образцы три раза 2x SSC в течение 20 минут за промывку при температуре 60 градусов Цельсия. Затем приготовьте первичное антитело в блокирующем буфере.

Загрузите в каждую лунку по 500 микролитров этой смеси. После этапа блокировки инкубируйте при комнатной температуре около четырех часов или при четырех градусах Цельсия в течение ночи. На третий день запустите цветовую реакцию в хромогенной подложке.

Накройте пластину с образцом алюминиевой фольгой. А во время реакции периодически проверяйте наличие чрезмерного окрашивания с помощью диссекционного микроскопа. На четвертый день важно провести инкубацию и отбеливание на световом коробе, так как это позволяет удалить любую пигментацию в образцах или окраску из раствора Буэна, а также усиливает сигнал зонда для четкой визуализации.

Затем после промывки SSC осторожно перенесите образцы кишечника, перевернув корзину в новую 24-луночную пластину. Находясь в лунках, тщательно промойте корзины, используя 70% этанол. Затем перейдите к визуализации образцов.

Крайне важно оценить качество РНК-зондов перед их использованием. Щупы можно проверить на формальдегидном геле. Если они выглядят как яркие, дискретные полосы, они хорошего качества.

При окрашивании некоторая изменчивость в распределении является нормальной среди биологических реплик, а также среди семи пар дивертикулов отдельных кишок. Поэтому лучше всего окрашивать не менее пяти кишок на каждое состояние, чтобы получить представление о среднем характере окрашивания. Общий успех лучше всего измеряется путем сравнения окрашивания смысловых и антисмысловых образцов для каждого состояния.

Оба должны разрабатываться в течение одинакового количества времени. Сенсорные образцы должны иметь минимальный фиолетовый цвет или вообще не иметь его, в то время как антисмысловые образцы должны иметь сильное окрашивание с минимальным фоном. Важно отметить, что ткани должны быть полностью погружены в пятно для равномерного воздействия.

Важно не допускать чрезмерного развития цветовой реакции. Это может привести к сильному окрашиванию фона, и образцы чувств могут начать выглядеть как антисмысловые образцы. Еще одним фактором, влияющим на результаты, является то, сколько клещей кормят заранее.

С клещами, которых не кормят или кормят всего 24 часа, трудно работать. Их кишки легче повреждаются и плохо окрашиваются. После освоения этой техники ее можно сделать за два с половиной или три дня, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что перед началом эксперимента необходимо держать наготове все расходные материалы, перечисленные в таблице реагентов и материалов. Спасибо за просмотр, и удачи в ваших экспериментах.