Краситель FM Велоспорт на синапсе: сравнение деполяризации высоким содержанием калия, электрических и Channelrhodopsin стимуляции

Общая цель данного эксперимента заключается в наблюдении за цикличностью эндо- и экзоцитоза синаптических везикул на живом препарате нервно-мышечного соединения личинок дрозофилы с использованием флуоресцентных FM-красителей. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, какие гены имеют решающее значение для функции цикла синаптических везикул? Основное преимущество этой методики заключается в том, что вы можете оптически отслеживать цикл везикул в живом препарате с помощью трех различных типов стимулов, высокой деполяризации калия, электрической стимуляции или с помощью оптогенетики.

Для проведения этой процедуры добавьте антитело против HRP, конъюгированное с лексофлором 647, к рассекающему физиологическому раствору. Затем добавьте покрытый эластомером покровный лист в камеру для вскрытия, а затем добавьте диссекционирующий раствор с антителом HRP для мечения пресинаптического терминаля NMJ во время диссекции. С помощью тонкой кисти перенесите блуждающий третий возраст из флакона с едой на покровное стекло с эластомерным покрытием.

Затем заполните стеклянный наконечник микропипетки небольшим объемом клея, используя отрицательное давление воздуха, создаваемое ртом. Затем расположите личинок спинной стороной вверх с помощью щипцов и приклейте голову к покрытому эластомером покровному листку с небольшой каплей клея, используя положительное давление воздуха ртом. Повторите эту процедуру с задним концом личинок, следя за тем, чтобы животное было натянуто натянуто между двумя клеевыми креплениями.

С помощью ножниц сделайте горизонтальный разрез в один миллиметр сзади и вертикальный разрез по спинной средней линии. Затем аккуратно удаляют тыльную часть трахеи, кишечника, жирового тела и других внутренних органов, покрывающих мускулатуру. Повторите процедуру приклеивания четырех лоскутов стенки корпуса, осторожно растягивая корпус как горизонтально, так и вертикально.

После этого поднимите VNC и осторожно разрежьте ножницами двигательные нервы и полностью удалите VNC. Замените диссекционный физиологический раствор на физраствор без кальция, чтобы остановить цикл SV. Для электростимуляции подготовьте отсасывающую пипетку с помощью съемника микроэлектродов, чтобы получить требуемый размер конуса и наконечника.

После этого отполируйте наконечник микроэлектрода с помощью микроковки, чтобы обеспечить плотное прилегание при всасывании одного двигательного нерва. Наденьте всасывающую пипетку на держатель электрода на микроманипуляторе, который прикреплен к длинной гибкой пластиковой трубке и шприцу. Далее поместите препарат с ФМ красителем на предметный столик микроскопа и поднимайте предметный столик до тех пор, пока личинки и всасывающая пипетка не окажутся в фокусе.

Затем всасывают петлю перерезанного моторного нерва, иннервируя выбранный сегмент полушария отрицательным давлением воздуха, создаваемым шприцем в отсасывающий электрод. Затем стимулируйте двигательный нерв с использованием выбранных параметров для управления эндоцитозом SV и поглощением красителя FM 143. Наиболее важным шагом на этом этапе процедуры является втягивание одного аксона двигателя в всасывающий электрод с плотной посадкой.

Для этого может потребоваться некоторое время проб и ошибок. После того, как будет найден подходящий аспирационный электрод, используйте его для всех сравниваемых условий, чтобы обеспечить постоянную стимуляционную нагрузку. Для разгрузки красителя FM втяните тот же двигательный нерв в тот же электрод, а затем стимулируйте двигательный нерв для активации экзоцитоза SV и высвобождения красителя FM 143.

Для стимуляции каналродопсина прикрепите синий светодиод к программируемому стимулятору с помощью коаксиального кабеля и поместите светодиод в порт камеры. Сфокусируйте синий светодиодный луч света на препарат с помощью FM-красителя с помощью функции зума микроскопа. Наиболее важным шагом на этапе процедуры является обеспечение постоянных настроек светодиодов и освещение одной и той же части каждого животного для всех сравниваемых условий, чтобы обеспечить постоянную стимуляцию.

Запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода оптогенетической стимуляции. Когда таймер остановится, быстро удалите раствор красителя FM и замените его безкальциевым физиологическим раствором, чтобы остановить цикл SV. Для выгрузки FM-красителя запустите световую стимуляцию и отслеживайте с помощью таймера заданную продолжительность периода стимуляции оптогенетики.

Когда период таймера закончится, быстро удалите раствор красителя FM и поместите его с физиологическим раствором, не содержащим кальция, чтобы остановить цикл SV. Чтобы количественно оценить флуоресцентное изображение, загрузите его на изображение J и создайте проекцию максимальной интенсивности, нажав Image, Stacks, Zproject, затем используя канал anti-HRP 647, перейдите в Image, Adjust, Threshold и сдвиньте верхнюю панель инструментов, пока не будет выделен только NMJ. С помощью инструмента «Палочка» нажмите на NMJ.

Если NMJ прерывистый, удерживайте кнопку Shift и выберите все детали. Затем измените изображение на канал красителя FM 143 и перейдите в раздел «Анализ, измерение», чтобы получить измерение флуоресценции. Повторите эти действия для выгруженного образа из того же NMJ.

Флуоресцентный FM 143 может быть фотопреобразован в окисленный электронно-плотный осадок DAB для визуализации с помощью TEM. Ниже приведена принципиальная схема метода преобразования фотографий для маркировки NMJ дрозофилы после активной загрузки красителя FM 143. Это репрезентативное ПЭМ-изображение синаптического бутона дикого типа в состоянии покоя, на котором видна плотная популяция SV одинакового размера.

На этих изображениях показаны синаптические бутоны, которые стимулировались высокой деполяризацией калийного раствора в течение пяти минут без фотоконверсии или с фотоконверсией FM 143. Здесь можно наблюдать объемные конечные структуры человека. На этих изображениях показаны синаптические бутоны, которые были электрически стимулированы с помощью электрода отсасывания нерва с частотой 20 Гц в течение пяти минут без фотоконверсии или с фотоконверсией FM 143.

Обратите внимание, что везикулы, загруженные красителем, кажутся намного темнее, чем соседние незагруженные везикулы. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнять вскрытие личиночного клея, а также загрузку и выгрузку FM-красителя с использованием высокой деполяризации калия, электростимуляции и стимуляции оптогенетического каналродопсина. С тех пор, как FM-красители были впервые синтезированы Фэй-Мао, эти универсальные красители использовались для изучения зависимой от активности мобилизации отдельных везикул для изучения различия между клатрин-опосредованным эндоцитозом, а также для изучения вызванной, спонтанной и миниатюрной синаптической активности.

В этом эксперименте необходимо учитывать множество факторов. Вот лишь некоторые из них: внешняя концентрация кальция, тип метода стимуляции, который вы используете, а также как долго нужно загружать и выгружать FM-краситель на этапах всасывания и высвобождения. Пожалуйста, внимательно учитывайте эти факторы при планировании собственного эксперимента.

Удачи!