Определение Hsp33 в редокс регулируемых Chaperone активность и сопоставления конформационные изменения на Hsp33 с использованием водорода дейтерия обмен масс-спектрометрия

Представленный здесь рабочий процесс может помочь расширить наше понимание клеточной роли шаперонов в условиях окислительного стресса. В частности, это может помочь понять, как шапероны предотвращают агрегацию белков в условиях развертывания. Ибо эти две спинки разных техник дают представление о деятельности сегрегированных сопровождающих.

Он также может быть использован для изучения взаимодействия других белков, таких как ферменты, социальные взаимодействия и динамика белка. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку она включает в себя использование различных инструментов, которые могут быть сложными для новых пользователей. Во-первых, раскрутите ранее размороженный образец белка, чтобы удалить агрегаты.

Затем добавьте пять миллимолярных DTT и 20 микромолярных хлоридов цинка и инкубируйте образец не менее 1,5 часов при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы удалить DTT, уравновесьте колонну для обессоливания буфером с 40 миллимолярами фосфата калия, полностью заполнив колонку буфером и дав ему вытечь. С помощью пинцета аккуратно надавите на белый диск фильтра в колонке и снимите его.

Наполните колонку калий-фосфатным буфером и центрифугируйте при 1000 умноженных на G в течение трех минут. После центрифугирования переложите колонку в чистую пробирку и медленно добавьте образец белка в середину колонки. Центрифугируйте колонку при 1000-кратном G в течение двух минут, чтобы белок, не содержащий DTT, оказался в потоке.

Теперь проверьте концентрацию белка и измерьте его поглощение на 280 нанометрах. Распределите половину образцов белка по аликвотам. Инкубировать аликвоты в анаэробных условиях в течение 20 минут для полного выведения кислорода.

Затем запечатайте пробирки полиэтиленовой пленкой и храните образцы в холодных условиях. Затем добавьте свежеприготовленную перекись водорода в пять миллимоляров к оставшемуся образцу белка и инкубируйте в течение трех часов при температуре 40 градусов Цельсия, встряхивая. После центрифугирования проверьте концентрацию белка, затем разделите окисленные белки на аликвоты и храните их в холодных условиях.

Денатурированный субстрат готовят путем инкубации 12 микромолярных цитратсинтаз в течение ночи в 40 миллимолярных HEPES и 4,5 молярных гуанидиния хлорида. На следующий день откройте программное обеспечение флуороспектрометра и перейдите к измерению временного курса. Установите ширину полосы возбуждения равной 2,5 нанометрам.

Длина волны возбуждения до 360 нанометров. Длина волны излучения до 360 нанометров. Ширина полосы излучения до пяти нанометров.

И интервал данных до 0,5 секунды. Установите температуру на 25 градусов по Цельсию. Подготовьте образец, добавив 1600 микролитров 40 миллимолярных HEPES в кварцевую кювету.

Вставьте кювету в держатель образца флуороспектрометра, чтобы образец достиг желаемой температуры. Установив перемешивание на 600 об/мин, начните измерение до тех пор, пока не будет установлен исходный уровень. Чтобы измерить агрегацию цитратсинтазы в отсутствие шаперона, добавьте 10 микролитров денатурированной цитратсинтетазы через 120 секунд после начала измерения.

Затем продолжайте измерение в течение 1200 секунд. Чтобы измерить агрегацию цитратсинтазы в присутствии Hsp33, добавьте Hsp33 через 60 секунд к измерению. Еще через 60 секунд добавьте 10 микролитров денатурированной цитратсинтетазы и продолжайте измерение в течение 1200 секунд.

Затем загрузите файл данных для выполнения анализа данных и удаления шума с помощью Kfits. Чтобы удалить любой шум, выберите параметры анализа, используйте автоматическую наилучшую модель и выберите шум всегда выше сигнала. Вручную удалите явные выбросы с помощью зеленой и красной регулируемых линий, которые отфильтруют шумы выше зеленой линии и ниже красной линии.

После этого задайте базовую линию и кривую посадки. После применения порога шума загрузите обработанные данные. Готовят образцы комплексов белкового субстрата путем добавления цитратсинтетазы к Hsp33 в соотношении 1 к 1,5 при 43 градусах Цельсия.

Используйте не менее четырех этапов и инкубируйте образцы в течение 15 минут при температуре 43 градуса Цельсия после каждого добавления, чтобы обеспечить образование сложного. Центрифугируйте образцы при 16000 умноженных на G и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут, чтобы удалить любые агрегаты. Затем поместите образцы в стеклянные вкладыши объемом 150 микролитров и переложите их во флаконы.

Затем разложите их по нужным лоткам. Удерживайте буферы H и D при температуре 25 градусов Цельсия, а образцы и буфер для закалки держите при температуре от нуля до двух градусов Цельсия. Далее вручную включаем все узлы охлаждения масс-спектрометра.

Как только все системы охлаждения достигнут заданной температуры, вручную включите насосы ВЭЖХ и загрузочные насосы. Откройте программное обеспечение, которое управляет обоими насосами, а также программное обеспечение, которое управляет масс-спектрометром, и убедитесь, что МС находится в режиме ожидания. После этого отсоедините выпускной клапан ВЭЖХ от источника МС.

Сначала промойте систему с помощью тройного очистителя. Затем с буфером B и, наконец, с буфером A. Затем вставьте колонку с пепсином в систему. После промывки системы постоянным потоком и постоянным давлением вставьте выпускной клапан ВЭЖХ в источник МС и включите МС.

Теперь откройте программу. Постройте последовательность выполнения и введите все временные точки, имена образцов и местоположения в лотках, а также имена и местоположения буферов. После завершения прогона проанализируйте пептидное покрытие образца, пропустив контрольные образцы без дейтерации через программное обеспечение.

Переносите данные в программное обеспечение HDX Workbench и анализируйте результаты с помощью программного обеспечения. Сохраните выбранные пептиды и продолжайте анализ поглощения дейтерия. Химическая денатурация приводит к быстрой агрегации цитратсинтетазы, вызванной повторным сворачиванием полностью денатурированного белка в неблагоприятных буферных условиях.

С другой стороны, термически индуцированная агрегация является результатом относительно медленного развертывания изначально сложенной подложки. При обеих формах денатурации добавление окисленного Hsp33 полностью устраняло агрегацию, снижая показания 360 нанометров до пренебрежимо малых значений. Присутствие восстановленного Hsp33 не влияло на стабильность цитратсинтетазы и давало кривую агрегации, аналогичную той, которая обнаруживалась при отсутствии шаперона.

Паттерн дейтерации между связанным и несвязанным шапероном Hsp33 и его субстратом цитратсинтетазой выявляет сайт взаимодействия клиента в домене С-концевого окислительно-восстановительного переключателя шаперона. Восстановленный Hsp33 имеет полностью упорядоченную структуру, но становится функциональным, когда чувствует окислительный стресс. В то время как восстановленный связанный и несвязанный Hsp33 дает сходные пептидные кривые, окисленный Hsp33 показывает 30%-ную дейтерационную разницу между связанным и несвязанным шапероном, при этом определенные участки связанного белка указывают на аллостерическое препятствие.

После того, как анализ на рассеяние установлен, он может быть завершен в течение нескольких часов, в то время как методология DHEX может быть завершена за два-четыре дня при правильном выполнении. При попытке выполнить эту процедуру важно спланировать все заранее. Помните, что описанные условия, такие как температура, время инкубации и буферные растворы, специфичны для белка и должны быть оптимизированы для каждого белка.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методологии, такие как сшивка или осаждение, чтобы дополнить исследования взаимодействий шапероновых субстратов. В заключение следует отметить, что этот метод проложил путь исследователям в области структурной биологии к изучению пластичности белков в молекулярных шаперонах.