На Ситу Микроскопия для определения одноклеточной морфологии в биопроцессах в режиме реального времени

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы неоднородности популяции с помощью морфологической оценки клеток. Микроскопия in situ позволяет изучать условия выращивания, урожайность процессов и качество продукции. Основным преимуществом этого метода является измерение на месте, которое предоставляет данные в режиме реального времени без отбора проб или риска загрязнения.

Микроскопия in situ соединенная к автоматизированному опознаванию изображения может обеспечить дополнительную информацию о клетчатых структурах, форме, и агломерации клетки за размером. Также можно измерить концентрацию клеток. Метод зарекомендовал себя как надежный инструмент.

Ни один альтернативный метод не предоставляет такую же информацию за столь короткое время и низкие усилия по подготовке образца. Метод был адаптирован к различным биопроцессорам и микроорганизмам, нитематозным грибам SEG, микроа аллергии и дрожжам. Зонд используется в сочетании с компьютером.

Оборудование состоит из одного стержня зонда с высоким разрешением CCD камеры. Ячейки, которые проходят через регулируемый зазор измерения, изображены камерой. Свет входит в зазор напротив камеры, то есть освещение по передаче.

Установите аппаратные параметры с использованием концентраций клеток, которые охватывают ожидаемый диапазон. Начните готовиться к офлайн-измерениям. Используйте датчик толщины для регулировки зазора измерения.

Затем поверните гайку винта зонда, чтобы установить зазор измерения в пять или 10 раз максимальный ожидаемый диаметр клетки. За компьютером откройте программное обеспечение контроллера зонда. В программном обеспечении выберите нужный зонд и перейдите к действиям раздела.

Затем нажмите Connect. Далее перейдите на вкладку Управления зондом и откройте ее. Начните потоковое видео, нажав кнопку воспроизведения.

Зафиксировать зонд на штатив и выполнить следующие шаги для каждого измерения. Работа с зондом и спрей этанола в измерении разрыва. Тщательно протрите любую пыль или грязь с помощью оптической бумаги.

За компьютером используйте живой вид, чтобы проверить, что стекло датчика не имеет частиц. Затем поместите сухую оптическую бумагу в зазор измерения для фокусировки. Поверните вязающий винт, чтобы переместить фокус вручную.

Прекратите фокусировку, когда четко видны одиночные волокна бумаги в зазоре измерения. Теперь возьми трубку, наполненную культурным бульоном. Опустите микроскоп в бульон, поэтому зазор полностью покрыт клеточной подвеской.

Используйте связывающие винты для точной настройки фокуса на ячейках. Как только эта фокусировка будет выполнена, не меняй ее снова во время эксперимента. Вернитесь к программному обеспечению для эксперимента.

Перейти к триггерного меню. В меню Триггеринга установите частоту кадров. Один герц рекомендуется для автономных измерений.

Оттуда перейдите на поле Frames Per Trigger и установите его по мере необходимости для хорошей статистики. Здесь около 200. Кроме того, перейдите в общее меню.

Там выберите каталог, в котором изображения будут сохранены. Начните приобретение изображений с помощью кнопки Start Image Trigger Acquisition. Аккуратно переместите трубку, чтобы вызвать поток в зазоре измерения.

Используйте изображения с первого запуска эксперимента в качестве учебного набора. Иметь программное обеспечение с открытым исходным кодом Фиджи готовы и падение изображения из эксперимента в свое окно. Когда это будет сделано, выберите Анализ, а затем инструменты, затем ROI Manager.

Далее выберите инструмент выбора. На изображении, принять решение о частице аннотировать, что находится в фокусе. Нарисуйте круг вокруг него с помощью инструмента выбора.

Нажмите Добавить, чтобы добавить аннотацию к roi Manager. Далее выберите инструмент кисти и выберите соответствующий размер пикселя. Используйте инструмент кисти для уточнения выбора.

Продолжить маркировку всех объектов, представляющих интерес таким же образом, около 15 изображений. Сохраните аннотированные файлы и используйте их в качестве учебного набора. Когда алгоритм распознавания обучен и готов, используйте его для визуализации результатов.

В анализаторе результатов перейдите в файл, за которым следует файл импорта. Там выберите нужный файл результатов. Продолжить, нажав кнопку Создать диаграмму.

Выберите диаграмму распределения. Это будет отображать морфологическое распределение культуры. Вернитесь к созданию диаграммы, чтобы выбрать участок чувствительности.

Отображаемая информация может помочь определить, сколько ячеек должно быть проанализировано, чтобы получить желаемую точность. Выполните онлайн-измерения после завершения автономных измерений. Для онлайн-измерений подключите зонд непосредственно к биореактору.

После подключения, правильно стерилизовать сборку. Выберите Мониторинг в панели мониторинга. Существует кнопка воспроизведения, чтобы начать получение изображения и кнопка остановки, чтобы закончить его.

Нажмите кнопку воспроизведения. В биореакторе начните прививку от культуры. Камера будет захватывать видео клеток и автоматически идентифицировать их для анализа.

Мониторинг предоставляет онлайн данные о размерах клеток и формах различных морфологий клеток в течение всего брожения. Результаты в режиме реального времени могут быть отформатированы различными способами, а также экспортироваться для дальнейшего анализа. Этот участок кумулятивного распределения диаметра клеток S.Cerevisiae создается на основе данных, проанализированных с помощью этой техники.

Он демонстрирует автоматическое распознавание клеток в состоянии различать начинающие и не подающий надежды клетки. Твердая кривая является распределение во время выращивания в три часа. Пунктирная кривая – это распределение одного и того же культивирования в семь часов.

Разбитая кривая представляет данные, собранные в 13 часов. Процедура аннотации занимает много времени, но она является ключом к достижению желаемой точности идентификации ячейки. С помощью этой процедуры, если время измерения короче, чем динамика процесса, измерение в режиме реального времени может быть использовано для управления процессом.

Этот метод прокладывает путь для использования измерения неоднородности популяции в качестве параметра процесса выращивания микробов от ранних этапов разработки процесса до производственного масштаба.