Гистотипическое культурирование тканей

Гистотипическая культура тканей позволяет выращивать клетки в трех измерениях, тем самым создавая морфологию тканей in vitro, которая точно имитирует реальную функцию ткани, которая может быть использована в качестве жизнеспособных конструкций для восстановления тканей. Эти культуры, как правило, представляют собой трехмерные структуры, состоящие из одного типа клеток, выращенных в высокой плотности. Трехмерная структура, также известная как каркас, имитирует естественный внеклеточный матрикс. В зависимости от типа используемых клеток, скаффолды могут быть разработаны для конкретного применения и обычно выступают в качестве шаблона для биомиметической ткани. В этом видео будут представлены основы гистотипических культур тканей, процедура выделения клеток, а также изготовление и клелюляризация каркаса из пористой шелковой ткани для имитации сердечной ткани.

Все ткани состоят из двух основных компонентов: внеклеточного матрикса и тканеспецифических клеток, которые его населяют. Внеклеточный матрикс представляет собой сеть структурных белков, которые создают трехмерную среду для клеток, а клетки внутри нее предназначены для повторения естественных физиологических процессов ткани. В настоящее время распространенным методом, используемым для моделирования ткани, является двумерная тканевая культура, при которой клетки распределяются на плоскую подложку и позволяют им образовать тонкую пленку. В целом, этот метод не является надежным для поддержания фенотипа in vivo, органоспецифичных функций, а также контекстуальных взаимодействий между клетками или между клетками и субстратом. Гистотипическая культура тканей устраняет эти ограничения, обеспечивая 3D-каркас для роста клеток, что приводит к созданию плотной сети клеток, которая более точно имитирует нативную морфологию клеток и способствует развитию реалистичных межклеточных сетей и путей коммуникации. Разнообразные 3D-полимерные сети, в том числе гидрогели и шелковые маты с электропрядением, предлагают удобные способы культивирования тканеспецифических клеток в трех измерениях. Для того, чтобы заселить эти каркасы, клетки должны быть изолированы. Первичные клетки, используемые в этом видео, собираются из живой ткани, которая измельчается, а затем расщепляется в растворе фермента для отделения клеток-мишеней от внеклеточного матрикса. После того, как клетки изолированы, существуют два метода, используемых для засеивания скаффолдов. Капельный метод включает в себя пипетирование раствора клеток на каркас с медленной и постоянной скоростью. Второй, или метод клеточной суспензии, погружает каркас в клеточную суспензию. Часто каркас и суспензию встряхивают, чтобы стимулировать миграцию клеток в матрикс. Оба метода приводят к созданию биоинженерных конструкций с высокой плотностью клеток. Следующие процедуры будут включать в себя выделение сердечных клеток и технику клеточной суспензии для создания каркаса, специфичного для сердечных клеток, поскольку он сохранит морфологию нативной сердечной ткани.

Чтобы начать процесс выделения клеток из донорской ткани, начните с того, что убедитесь, что рабочая зона и инструменты для диссекции стерилизованы. Затем поместите стерильную простыню на рабочую поверхность в шкафу биобезопасности. Поместите стерильные хирургические инструменты на простыню, не касаясь их, а затем откройте стерильное лезвие скальпеля No 20. После усыпления образца простерилизуйте операционную область с помощью марлевой салфетки, смоченной бетадином. Когда все будет готово, закрепите образец и начните хирургическую процедуру по выделению интересующей ткани. В данном случае это будет сердце. После иссечения поместите ткань на лед в чашку Петри, содержащую глюкозу PBS. Удалите остатки крови или соединительной ткани, а затем перенесите ткань в чашку Петри со свежей глюкозой PBS. Затем, используя стерильные микроножницы и щипцы, осторожно измельчите образцы ткани примерно на 1 кубический миллиметр. С помощью пипетки перенесите кусочки и буфер в коническую трубку. Затем удалите все, кроме 10 миллилитров буфера. Добавьте 7 миллилитров раствора коллагеназы, а затем встряхните смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 7 минут. Затем аккуратно пипеткой 10 раз, чтобы разбить кусочки ткани. Дайте кусочкам осесть, а затем вдохните жидкость и выбросьте ее. Далее повторите вываривание и аккуратно пипетируйте раствор, чтобы разбить кусочки ткани. После того как кусочки осядут, оттяните надосадочную жидкость и соберите ее в отдельную коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем добавьте 10 миллилитров раствора STOP в каждую коническую пробирку, содержащую надосадочную жидкость, чтобы остановить пищеварение.

Теперь, когда первичные клетки выделены, давайте изготовим каркас из пористой шелковой ткани. Для начала налейте 30 миллилитров раствора шелка в форму. Далее равномерно рассыпьте по раствору 60 грамм просеянного хлорида натрия. Затем дайте шелку полимеризоваться при комнатной температуре в течение 48 часов. Затем поместите форму в духовку при температуре 60 градусов на 1 час, чтобы завершить сшивание и испарить оставшуюся жидкость. После полимеризации погрузите форму в стакан с дистиллированной водой на 48 часов, чтобы удалить соль. Затем извлеките каркас из формы и вырежьте небольшие диски с помощью 5-миллиметрового пробойника для биопсии. Обрежьте диски на высоту 2 миллиметра и, наконец, удалите центры каждой детали с помощью 2-миллиметрового биопсийного перфоратора, чтобы создать кольцо. Наконец, автоклавируйте леса во влажном цикле в течение 20 минут.

Когда каркас подготовлен, приступим к процессу засева ячеек. Во-первых, поместите по одному стерильному каркасу на лунку в планшет на 96 лунок. Затем добавьте среду для клеточных культур, чтобы погрузить каркасы, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур, чтобы уравновесить их в течение не менее 30 минут. После инкубации аспирируйте избыток среды, а затем добавьте изолированную суспензию первичных клеток в каркасы. Далее верните тарелку в инкубатор и оставьте на ночь, чтобы клетки прикрепились к лесам. На следующее утро осторожно аспирируйте неприкрепленные клетки и замените их 200 микролитрами свежей среды для культивирования клеток на лунку. Полученный каркас представляет собой пористую конструкцию с высокой плотностью ячеек, готовую к использованию.

Теперь, когда вы узнали, как проводить гистотипическое культивирование тканей, давайте рассмотрим некоторые практические применения этих материалов. Гистотипическая культура тканей может создавать клеточные микроокружения, которые имитируют нативные ткани, и в результате могут обеспечить подходящую модель для изучения клеточного поведения в отношении одного типа клеток. Например, 3D-волокно в скаффолдах, которое более точно имитирует нишу стволовых клеток, обнаруженную in vivo, может быть засеяно плюрипотентными стволовыми клетками для скрининга биологических сигналов и определения их влияния на дифференцировку стволовых клеток. Эта работа может в конечном итоге обеспечить более глубокое понимание того, как дифференцируются стволовые клетки, и может дать представление об усилении дифференцировки и регенерации клеток для приложений тканевой инженерии. Как и в случае с динамическими культурами, механическое кондиционирование также может улучшить 3D-тканевый каркас, подвергая его различным механическим нагрузкам, которые естественная ткань может испытывать in vivo. При приложении компрессионных и биаксиальных нагрузок во время роста клеток, морфология клетки и внеклеточный матрикс изменяются, чтобы отразить эти механические нагрузки. В результате получается предварительно подготовленный биоинженерный тканевый каркас с клеточной структурой, напоминающей нативную ткань, что делает его идеальным для имплантации в области, которые могут испытывать аналогичные механические силы. Наконец, сконструированные тканевые конструкции также могут быть использованы для замены или восстановления тканевых дефектов. Для того чтобы достичь этого, тканевый каркас должен быть сначала васкуляризирован, тем самым позволяя крови свободно перемещаться по конструкции. После васкуляризации каркас может быть перенесен и имплантирован в дефект ткани, чтобы начать восстановление. Успешная трансплантация может быть позже подтверждена с помощью гистологии, которая показывает, полностью ли тканевая конструкция восстановила поврежденный участок.

Вы только что посмотрели введение Юпитера в гистотипическую культуру тканей. Теперь вы должны понять, как готовятся простые 3D-структуры, как выделяются первичные клетки и засеиваются на каркас, а также как различные применения этих культур в области биоинженерии. Спасибо за просмотр.