На месте Измерение и корреляции плотность клеток и светового излучения биолюминесцентных бактерий
28 июня 2018 г.
Биолюминесцентных бактерий регулируют света производства через различные механизмы, например кворума. Этот новый метод позволяет на месте расследования биолюминесценции и корреляции светового излучения в плотность клеток. Искусственные биолюминесцентных Escherichia coli система позволяет характеристика опероны люкс , Люкс белков и их взаимодействие.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биолюминесценции. Например, поиск оптимальных условий роста для максимальной интенсивности освещения биолюминесцентных бактерий и определение регуляторного механизма. Основным преимуществом этой методики является простота настройки, которую можно использовать для различных штаммов и организмов, а также возможность простой и быстрой настройки.
Следование этому методу может дать представление о характеристиках люкс-оперона. Он также может быть применен к другим системам, таким как бактериальные, экологические, системы отчетности или датчики. Для начала приготовьте ночную культуру, инокулировав 100 миллилитров среды LB канамицином, с трансформированными клетками E.coli BL21 из глицеринового запаса или непосредственно из трансформационного планшета.
Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 120 оборотах в минуту в течение ночи. На следующий день инокулируйте 800 миллилитров среды LB канамицина с 8 миллилитрами ночной культуры. Инкубируйте культуру при температуре 37 градусов Цельсия и 120 об/мин в шейкере инкубатора, пока плотность клеток не достигнет OD600 от 0,6 до 0,8.
Снизьте температуру инкубации до 28 градусов Цельсия и стимулируйте экспрессию белка путем добавления 0,1 миллимоляра IPTG. Затем наблюдайте за клетками, пока они не начнут блестеть. После подготовки среды в соответствии с текстовым протоколом нанесите бактериальные биолюминесцентные штаммы на агаровые пластины искусственной морской воды и инкубируйте их при температуре от 24 до 30 градусов Цельсия в течение ночи.
Приготовьте культуру на ночь, введя 100 миллилитров искусственной морской водной среды в одну колонию из тарелки. Затем инкубируйте культуру при температуре от 24 до 30 градусов Цельсия и 120 об/мин в течение ночи. На следующий день введите 800 миллилитров искусственной морской водной среды с 8 миллилитрами ночной культуры.
Инкубируйте бактериальные клетки при температуре от 24 до 30 градусов Цельсия и 120 оборотах в минуту и наблюдайте за клетками, пока они не начнут сиять. Нанесите желаемый биолюминесцентный штамм бактерий или модифицированный штамм E.coli на агаровую пластину и инкубируйте культуру при температуре 28 градусов Цельсия в течение ночи. Введите 3 миллилитра среды с одной колонией из ночного планшета и инкубируйте клетки при температуре 28 градусов Цельсия и 180 оборотах в минуту в течение примерно одного-двух часов.
Измерьте плотность клеток при разведении жидкой культуры в соотношении 1:10 на 650 нанометров. Затем рассчитайте соотношение и объем для одного миллилитра культуры с OD650 0,05. Пипеткой рассчитанный объем культуры и среды поместите в 24 лунки с черными стенками и стеклянным дном.
Чтобы вектор pET28a, содержащий весь люкс-оперон, не потерялся и который экспрессируется в модифицированном штамме E.coli, добавьте в образцы один микролитр канамицина и один микролитр IPTG. Затем накройте тарелку крышкой, чтобы избежать испарения во время измерений. Наконец, используйте считыватель пластин, настроенный на 28 градусов Цельсия, и скрипт, найденный в текстовом протоколе, чтобы проводить измерения поглощения и биолюминесценции каждые 10 минут, с встряхиванием между точками данных.
На этом рисунке сравниваются измерения OD650 клеток E.coli BL21, клеток BL21, содержащих пустой вектор pET28a, и клеток BL21, содержащих вектор pET28a с опероновой вставкой lux-rib, но без индукции. Все три эталонных измерения светового излучения показывают сигмоидальную кривую роста с запаздывающими, экспоненциальными и стационарными фазами роста, но без светового излучения, за исключением последнего образца, который показывает световое излучение через 300 минут из-за утечки промотора Т7. Здесь сравнивали кривые роста и интенсивность света люкс-оперона, выраженного в E.coli, и биолюминесцентного бактериального штамма, фотобактерии mandapamensis 27561, при температуре 28 градусов Цельсия в LB, или искусственной морской водной среде.
Модифицированный штамм E.coli и P.mandapamensis растут в искусственной морской воде, а также в среде LB, и оба демонстрируют световое излучение. Но в среде LB P.Mandapamensis вообще не излучает света. Примечательно, что модифицированный штамм E.coli показывает более высокую максимальную интенсивность света, чем биолюминесцентные бактерии.
В этом эксперименте экспрессия генов lux-rib оперона на основе E.coli измерялась в течение 24 часов для анализа его долговечности. Световое излучение длилось 19 с половиной часов, что намного дольше, чем у бактериальных штаммов, где наблюдалось постепенное снижение, что привело к очень низкому световому излучению через 10 часов. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биолюминесценции к изучению lux-оперонов в модельных организмах, таких как E.Coli.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как работать с биолюминесцентными бактериями.
Обзор
В данной статье рассматривается метод исследования биолюминесцентных бактерий с акцентом на регуляцию продукции света посредством чувства кворума и характеристику lux-оперонов в искусственной системе E. coli.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биолюминесценция
- Микробная генетика
- Клеточная сигнализация
Теоретические основы
- Биолюминесцентные бактерии способны излучать свет, интенсивность которого регулируется различными механизмами.
- Кворум-сенсинг играет ключевую роль в продукции света.
- Понимание работы lux-оперонов необходимо для манипуляций с биолюминесценцией.
- Данное исследование может быть применено к различным штаммам и организмам.
Цель исследования
- Определить оптимальные условия роста биолюминесцентных бактерий.
- Изучить регуляторные механизмы продукции света.
- Получить представление о характеристиках люкс-оперона.
Используемые методы
- Подготовка ночных культур E. coli с lux-оперонами.
- Индукция экспрессии белка с помощью IPTG.
- Измерение интенсивности светового излучения и плотности клеток с помощью планшетного ридера.
- Сравнение кривых роста и интенсивности свечения модифицированных штаммов E. coli и биолюминесцентных штаммов.
Основные результаты
- Модифицированный штамм E. coli демонстрировал более высокую интенсивность свечения, чем природные биолюминесцентные бактерии.
- Эмиссия света от lux-оперона продолжалась значительно дольше, чем от бактериальных штаммов.
- Кривые роста продемонстрировали отчетливые фазы с различной интенсивностью свечения.
- Данный метод позволяет легко настроить и адаптировать систему для различных организмов.
Выводы
- Этот метод углубляет понимание биолюминесценции в модельных организмах.
- Он служит платформой для дальнейшего изучения lux-оперонов.
- Будущие исследования могут использовать этот метод для различных приложений в области микробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет проводить стандартизированную количественную оценку функции lux-оперона в сконструированных микробных системах, что способствует валидации мишеней в синтетической биологии и разработке биосенсоров. Путем отделения измерения биолюминесценции от нативного регулирования чувства кворума создается контролируемая платформа для механистического снижения рисков при создании генетических конструктов. Этот подход обеспечивает прогностическую уверенность в динамике экспрессии генов и функциональности белковых комплексов, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшего продолжения работ (go/no-go) на ранних этапах процессов поиска и разработки.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать компоненты lux-оперона и их взаимодействие посредством систематического делетирования или замещения генов.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию генетических конструкций путем корреляции интенсивности излучения света с плотностью клеток в условиях контролируемой индукции.
- Прогностическая ценность: облегчает оценку формирования белковых комплексов (например, LuxCDE) с использованием устойчивого светового сигнала в качестве функционального показателя.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает воспроизводимые данные люминесценции и OD650 с временным разрешением, подходящие для адаптации к высокопроизводительному скринингу.
- Количественные показатели: предоставляет рациометрические измерения (свет на клетку), позволяющие проводить нормализацию для различных штаммов и условий.
- Повторное использование платформы: создает модульную систему для тестирования вариантов lux-оперона или экспрессии гетерологичных белков в E. coli.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает релевантную с точки зрения заболевания систему для изучения путей бактериальной сигнализации при использовании lux в качестве репортера в моделях инфекции.
- Механистическое снижение рисков: позволяет изолировать функцию гена lux от нативных регуляторных сетей, что уменьшает неопределенность при установлении связи между фенотипом и генотипом.
- Прогностическая достоверность: позволяет проводить долгосрочную оценку стабильности экспрессии генов, что критически важно для определения долговечности биосенсоров.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от валидации генетических конструктов до разработки анализа, что позволяет проводить итерационные циклы «проектирование-сборка-тестирование» для оптимизации биосенсоров.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о функции гена lux и влиянии регуляторных элементов с помощью индуцибельной экспрессии и мониторинга в режиме реального времени.
- Скрининг: обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые показатели люминесценции, совместимые с форматами многолуночных планшетов для сравнительной оценки штаммов или вариантов.
- Аналитика: обеспечивает получение данных по двум параметрам (OD650 и люминесценция), что позволяет рассчитывать удельные показатели эмиссии света для количественного сравнения.
- Трансляционные исследования: применимо в доклинических исследованиях, когда lux используется в качестве репортера при визуализации живых клеток или в моделях инфекций, требующих стабильного выходного сигнала.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую индуцибельную платформу на основе E. coli, применимую в различных проектах по характеристике генетических цепей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность, позволяя напрямую сопоставлять генетическую модификацию с количественным выходом света.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию анализа за счет определенных протоколов индукции, контроля температуры и рациометрической нормализации.
- Стратегическая ценность: Повышает уверенность при принятии решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя ранние количественные данные об эффективности генетических конструкций.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию генетических вариантов с поправкой на риск на основе функциональных профилей световой эмиссии.
Особенности реализации
- Требуются навыки молекулярного клонирования, культивирования бактерий и работы с планшетным ридером для одновременного детектирования абсорбции и люминесценции.
- Метод зависит от наличия оборудования, способного обеспечить синхронное перемешивание и циклы измерения абсорбции/биолюминесценции с контролем температуры.
- Необходима стандартизация уровней индукции IPTG и протоколов разведения по OD650 для разных пользователей и лабораторий.
- При расширении метода на hosts, отличные от E. coli, или альтернативные репортерные системы требуются соответствующие адаптации.
- Метод ограничен требованиями к стабильности плазмид, что обуславливает необходимость использования антибиотиков при измерениях для предотвращения потери конструкции.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
Expression of Modified E. coli Strains
1:41
Expression of Bacterial Bioluminescent Strain
2:27
In Vivo Activity Assay for Bacterial Bioluminescent Strains and Modified E. coli Strains
3:49
Results: Cell Density and Light Emission of lux Operon in E. coli
5:27
Conclusion
