Microphysiologic платформа для человеческого жира: зажатой белой жировой ткани

Этот революционный метод впервые позволяет нам сохранять жир живым и здоровым ex vivo в течение нескольких недель подряд для изучения биологии жировой ткани. Основное преимущество этого метода заключается в том, что ткань остается стабильной в течение восьми недель в культуре, рекапитулируя жировое микроокружение, включая окружающие нативные жировые стромальные поддерживающие клетки. Начните с посева ASC с конфлюенцией примерно 80% в планшетах для культивирования тканей.

Для каждой лунки желаемого SWAT засейте одну лунку для традиционной культуры тканей и одну лунку соответствующего размера на пластиковой пластине для культуры тканей с покрытием PNIPAAm. Поддерживайте ASC в полной питательной среде при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2 в течение шести-восьми дней, меняя среду каждые два дня. За двадцать четыре часа до посева SWAT не менее двух раз обмотайте ободок плунжера каждого плунжера для посевного аппарата SWAT не менее двух раз, чтобы предотвратить утечку желатинового раствора.

В продезинфицированном этанолом шкафу биобезопасности распылите 15 миллилитровый конический штатив для пробирок, содержащий пустые, незакрытые 15-миллилитровые конические трубки, а также каждый обернутый лентой поршень с 70% этанолом, помещая каждый поршень в пустую трубку во время его дезинфекции. Распылите примерно 6,3 грамма на металлические шайбы и поместите их на стойку вместе с парой крючковатых щипцов. Затем закройте створку шкафа и включите ультрафиолетовый свет, чтобы облегчить ночную сушку и стерилизацию материалов посевного аппарата.

Когда клетки достигнут 100% слияния и продемонстрируют бороздчатый рисунок, добавьте 0,75 грамма порошка желатина в 10 миллилитров HBSS. И сбалансируйте pH раствора 100 микролитрами гидроксида натрия. Добавьте желатин на водяную баню при температуре 75 градусов Цельсия и энергично встряхивайте тюбик каждые пять минут, пока порошок не растворится в растворе.

Однородный желатиновый раствор процедите через шприц-фильтр и нанесите желатин на поршни. Заклеенные края поршней будут служить формой, пока желатин застывает. Когда желатин застынет, разверните ленту и с помощью крючковых щипцов удалите желатин с внешнего края поршня, следя за тем, чтобы оставшийся желатин в центре поршня был полностью ровным, чтобы максимально соприкоснуться с листом ASC.

После того, как желатин будет удален из всех поршней, аккуратно приложите каждый поршень к пластине ASC с покрытием PNIPAAm, используя металлические шайбы, чтобы утяжелить поршни. После 1,5-часовой инкубации при комнатной температуре пластины переложить в ванну с ледяной водой еще на 1,5 часа для завершения диссоциации клеточного листа с поверхностью пластины, покрытой ПНИПААА. Затем очистите дно пластин с покрытием PNIPAAm, чтобы удалить нестерильную воду.

После получения жировой ткани человека добавьте среду для культивирования холодных клеток в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл на каждую посевную культуру. И промывайте большие сегменты жировой ткани три раза в стерильном PBS, удаляя как можно больше PBS между промывками. После последнего промывания с помощью щипцов и стерильной бритвы крупно измельчите ткань, удаляя как можно больше сосудистой сети и фасций до тех пор, пока раствор не приобретет густую жидкую консистенцию с как можно меньшим количеством видимых отдельных сегментов белой жировой ткани.

Как только будет достигнута надлежащая консистенция ткани, используйте модифицированный наконечник микропипетки P1000 для переноса соответствующего объема измельченной ткани в каждую предварительно подготовленную пробирку объемом 1,5 миллилитров и кратковременно перемешайте измельченную салфетку со средой внутри пробирок. Затем замените среду в каждой культуре ASC одним объемом раствора белой жировой ткани и аккуратно перенесите желатиновые поршни в смесь белой жировой ткани на базовых пластинах ASC. Изучите монослои в пластинах с покрытием PNIPAAm под микроскопом, чтобы подтвердить клеточную отслойку, и переместите пластины на поверхность теплового блока с температурой от 37 до 40 градусов Цельсия в шкафу биобезопасности.

Затем добавьте два-три миллилитра подогретой питательной среды для инкубации клеток и облегчения плавления желатина. Через 30 минут аккуратно снимите поршни с поверхности планшета, накройте культуры соответствующими крышками планшетов и поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур. Когда желатин полностью разжижается, аспирируйте и замените среду для культивирования клеток соответствующим объемом феноловой свободной среды M199 с добавлением инсулина, дексаметазона и антибиотиков.

В течение 7,5 недель культивирования кластеры SWAT остаются на месте на монослое, при этом в отдельных адипоцитах наблюдаются лишь незначительные морфологические изменения. Прозрачное окрашивание кластеров однокамерных адипоцитов в красный цвет Нила через две недели посева демонстрирует, что клетки действительно являются адипоцитами с неповрежденными мембранами, а не артефактами, кистами или мертвыми адипоцитами. Йодидное окрашивание пропидия 53-дневным SWAT и окрашивание Oil Red O 51-дневных культур SWAT подтверждают, что адипоциты сохраняют жизнеспособность даже в поздние временные сроки.

Иммуноцитохимия демонстрирует соответствующую ожидаемую экспрессию белка и локализацию зрелых маркеров адипоцитов в SWAT, а количественная ПЦР указывает на экспрессию ключевых генов адипоцитов на транскрипционном уровне. Оценка эндокринной функции базилика указывает на секрецию лептина базилика из культур SWAT, обнаруженную с помощью ИФА, а также на высвобождение глицерина в ответ на химическую стимуляцию. Ксенотрансплантация адипоцитов, культивируемых SWAT, выявляет четко видимые и легко восстанавливающиеся жировые отложения через 10 дней после трансплантации, которые окрашивают маркеры адипоцитов человека, но не мыши.

После освоения этой техники ее можно выполнить примерно за пять часов, если она выполнена правильно. Важно помнить о необходимости быстрой обработки первичной ткани, чтобы свести к минимуму гибель клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как количественная ПЦР в реальном времени, иммуноокрашивание или функциональные анализы, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как адипоциты реагируют на различные лекарства или токсины.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить культуру SWAT в качестве стабильной и надежной платформы для ваших исследований жировой ткани. Не забывайте, что работа с первичными тканями человека может быть опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение надлежащих СИЗ и обращение с салфетками под шкафами биобезопасности.