Определение белка субцеллюлярные локализации зеленый флуоресценции белков пометки и 4', 6-Diamidino-2-phenylindole окрашивание Caenorhabditis elegans

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области C.elegans, такие как клеточная биология. Основное преимущество этой методики заключается в том, что с ее помощью можно быстро и эффективно получать сигналы об изменении ядерного окрашивания, GFP и субклеточной локализации одновременно. Для начала сгенерируйте экстрахромосомный массив, выровненный с трансляционной конструкцией генов-мишеней.

В качестве альтернативы можно получить такие линии в Генетическом центре Caenorhabditis, который является общедоступным ресурсом для исследований C.elegans. Или из ранее опубликованной исследовательской лаборатории. После воздействия на червей гамма-излучения для интеграции внехромосомных линий в геном, выберите стабильно экспрессируемые линии, чтобы каждое животное экспрессировало маркерный белок, такой как GFP или ролик.

Чтобы удалить мутации, образовавшиеся во время облучения, пересеките линии не менее двух раз. Используйте полученную трансгенную линию для обнаружения изменений паттерна экспрессии белка под действием стресса. Затем, после подготовки червячных пластин NGM в соответствии с текстовым протоколом, разрежьте клон OP50 и культивируйте бактерии в жидком бульоне LB в течение ночи.

Засейте пластины NGM жидкой культурой OP50 и инкубируйте пластины в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия на ночь, чтобы вырастить газон из бактерий в качестве источника пищи для червей. Перед использованием охладите пластины при комнатной температуре не менее чем за 30 минут. Выращивайте трансгенную линию при температуре 20 градусов Цельсия без голодания, по крайней мере, в течение двух поколений до анализа теплового стресса.

Выберите восемь-десять молодых взрослых особей для новой червячной пластины. Затем дайте им отложить яйца примерно на три-пять часов, и удалите всех взрослых особей из тарелок. Чтобы синхронизировать червей, дайте яйцам вылупиться и вырастите личинки в течение примерно 48 часов до четвертой личинки, или стадии L4.

Это можно определить по вульве, которая представляет собой структуру в форме полумесяца. Затем подвергните червей тепловому стрессу, инкубируя пластины с личинками L4 при температуре 35 градусов Цельсия в течение двух-пяти часов. Включите в инкубатор термометр, чтобы точно измерить температуру.

Нанесите пипеткой 10 микролитров M9 на центр предметного стекла. Затем выберите червей, подвергшихся тепловому удару, и переложите их в каплю буфера. В качестве альтернативы используйте M9, чтобы смыть червей с пластины.

Затем центрифугируйте образец при 1000-кратном давлении при комнатной температуре в течение одной минуты. Выбросьте надосадочную жидкость, затем добавьте червей на предметное стекло. Под препарирующим микроскопом используйте мягкие ткани, чтобы слить лишнюю жидкость.

Затем, еще находясь под микроскопом, добавьте 10 микролитров 95%-ного спирта на червей и продолжайте наблюдать за ними. Сразу после того, как этанол высохнет, повторите добавление этанола еще два раза. Он имеет решающее значение для процесса испарения этанола у животных под микроскопом.

Как только этанол сойдет с животных, немедленно приступайте к следующему этапу. Добавьте к червям 10 микролитров DAPI. Сразу же наклейте чехол и заклейте горку прозрачным гелем для лака.

Дав лаку закрепиться примерно 10 минут, полюбуйтесь животными под флуоресцентным микроскопом. Чтобы зафиксировать животных ацетоном, используйте M9, чтобы смыть пластину, подвергшуюся тепловому удару, и центрифугировать образец при 1000-кратной гравитации при комнатной температуре в течение одной минуты. Выбросьте надосадочную жидкость и используйте один миллилитр дистиллированной воды для промывки гранул.

После удаления надосадочной жидкости добавьте 400 микролитров 30% ацетона и выдержите образец в течение 15 минут. Затем центрифугируйте пробирку при 1000-кратном давлении при комнатной температуре в течение одной минуты. Выбросив надосадочную жидкость, используйте 500 микролитров дистиллированной воды для мытья животных два раза.

Добавьте в гранулу 200 микролитров DAPI, или в четыре раза больше общего объема червей в пробирку, и инкубируйте образец в течение 15 минут. Центрифугируйте образец и выбросьте надосадочную жидкость. Затем используйте 500 микролитров дистиллированной воды, чтобы промыть гранулу два раза перед установкой и визуализацией, как раньше.

Чтобы провести съемку, включите источник ультрафиолетового света и флуоресцентный микроскоп. Затем включите компьютер, подключенный к микроскопу. Загрузите предметное стекло на флуоресцентный микроскоп.

Используйте объектив с 10-кратным увеличением, чтобы обнаружить червей. Затем увеличьте мощность увеличения до 400X и сфокусируйтесь на образце. Затем откройте программное обеспечение, поставляемое с микроскопом.

Нажмите «Захват», затем нажмите «Камера» и выберите камеру, подключенную к микроскопу. В том же окне «Приобретение» нажмите на «Многомерное получение». Откроется новое окно навигации по многомерному сбору данных.

Нажмите кнопку многоканальности, и появятся все доступные каналы. Выберите синий, зеленый и DIC для наблюдения за образцом. В окне навигации «Многомерная съемка» оставьте включенными синие каналы DAPI, зеленый GFP и серый DIC и щелкните правой кнопкой мыши другие каналы, такие как красный Rhodamine и белый Brightfield, чтобы закрыть их.

Чтобы измерить время экспозиции для каждого канала, щелкните левой кнопкой мыши синий канал DAPI, чтобы выбрать его, и нажмите «Измерить», чтобы получить изображение в реальном времени с автоматическим временем экспозиции. В левой части окна живого изображения при необходимости вручную отрегулируйте время экспозиции, затем нажмите OK. Настройте время экспозиции для каналов GFP и DIC аналогичным образом. В навигационном окне «Многомерная съемка» нажмите «Пуск», чтобы автоматически собрать три изображения по трем различным каналам в порядке с заданным временем экспозиции.

Чтобы сохранить файл, в главном меню нажмите на Файл, Сохранить как.Введите имя файла и папку. Сохраните файл в формате по умолчанию, чтобы сохранить подробную информацию об изображении для использования в будущем. Чтобы экспортировать файл в другие форматы, в разделе Файл нажмите кнопку Экспорт.

Задайте имя файла и папку. Установите флажок «Создать папку проекта», чтобы лучше организовать данные. Выбрав нужный тип файла из выпадающего меню, нажмите «Пуск» для экспорта.

У C.elegans существуют два гомолога хлоридных белков внутриклеточного канала, exl-1 и exc-4. Недавнее исследование показало, что exl-1 регулирует управление стрессом у животных. Здесь трансляционная конструкция exl-1 GFP была интегрирована в геном животного и созданы трансгенные линии, которые стабильно экспрессируют зеленый флуоресцентный exl-1.

При тепловом стрессе exl-1 GFP накапливается в ядре в области кишечника, поскольку сильный сигнал GFP перекрывается с ядром. Для подтверждения субклеточной локализации exl-1 было проведено окрашивание DAPI у животных с фиксированным этанолом и ацетоном. Оба метода показывают четкие ядра в организме животного, а перекрывающиеся сигналы GFP и DAPI подтверждают, что exl-1 GFP действительно накапливался в ядрах в области кишечника.

После освоения этой техники ее можно выполнить за один час, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выполнить быструю фиксацию для сохранения сигнала GFP и ядерной транслокации белка при стрессе у C.elegans.