Оптическое биозондирование
Оптические биосенсоры используют свет для обнаружения связывания молекулы-мишени. Эти датчики могут использовать молекулу-метку, которая производит из…
Оптические биосенсоры — это датчики, которые обнаруживают биологическую цель или интересующие цели с помощью света. Эти устройства нашли применение в здравоохранении, фармацевтике, мониторинге окружающей среды, национальной безопасности и даже на полях сражений. Оптические биосенсоры в целом делятся на датчики на основе меток и без меток. Примером зондирования на основе меток является полимеразная цепная реакция, или ПЦР, в которой используются флуоресцентные метки или флуорофоры для количественного определения амплифицированной целевой ДНК. Примером метода без меток является поверхностный плазмонный резонанс, или SPR. В этом случае взаимодействие неизмененных биомолекул с поверхностью сенсора количественно оценивается путем измерения фундаментальной характеристики сенсора, такой как угол отражения. В этом видео рассматриваются основы обоих типов методов оптической биосенсорной диагностики и ее критически важных компонентов, принципы работы и общие области применения оптических биосенсоров.
Во-первых, давайте рассмотрим общие принципы оптического биозондирования на основе меток. Как правило, зонд или элемент биораспознавания, такой как комплементарное антитело, прикрепляется к поверхности сенсора с помощью традиционной иммобилизационной химии. Затем раствор образца наносится на поверхность датчиков. Молекула-мишень, которая является комплементарной к иммобилизованному элементу биоузнавания, селективно захватывается из раствора сложного образца. Затем излишки раствора образца смываются буфером или водой. Затем, чтобы помочь визуализировать и количественно оценить количество связанной мишени, через систему пропускают вторичную молекулу, которая является комплементарной к мишени и прикреплена к флуорофору. Через некоторое время, когда произошло связывание вторичной молекулы с мишенью, избыток несвязанного флуорофора смывается. Затем интенсивность связанного флуорофора может быть количественно определена с помощью флуоресцентного микроскопа. Эта интенсивность сначала строится на график для различных известных концентраций целей для создания калибровочной кривой, которая затем позволяет напрямую измерить неизвестное количество захваченной цели. Таким образом, методы, основанные на метках, используют интенсивность флуоресценции чрезвычайно чувствительных флуорофоров для количественной оценки концентрации интересующей биомолекулы.
Теперь, когда мы рассмотрели принципы работы оптических биосенсоров на основе меток, давайте рассмотрим часто используемый пример — текущий стандарт амплификации ДНК, количественной ПЦР или количественной ПЦР. Реакционная смесь для количественной ПЦР включает в себя маркированный зонд для количественного определения реакции в режиме реального времени. Последовательность зонда прикрепляется как к молекулам флуоресцентного репортера, так и к молекуле гасителя и связывается с определенной последовательностью ДНК. Молекула гасителя гасит излучение флуорофора, в то время как оба они прикреплены к зонду. Во время ПЦР-реакции фермент полимераза разрушает ДНК зонда и физически отделяет флуорофорный репортер, тем самым предотвращая гашение и приводя к увеличению флуоресценции. Чтобы провести кПЦР, сначала добавьте все компоненты реакции, включая меченые зонды, в пробирку или лунку для ПЦР. Далее поместите лунки для ПЦР в специализированный амплификатор и введите параметры для каждого цикла и количество циклов. Амплификатор, используемый для количественной ПЦР, включает в себя источник света с необходимыми оптическими компонентами для выбора длины волны и детектор для измерения интенсивности флуоресценции в режиме реального времени во время реакции ПЦР. В конце каждого теплового цикла регистрируется и строится график интенсивности флуоресценции, обусловленной высвобождением флуорофоров. Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна логарифму целевой концентрации в реакционной лунке, и, таким образом, для известной флуоресценции можно рассчитать неизвестную целевую концентрацию.
Давайте теперь рассмотрим, как можно добиться сенсорного восприятия без каких-либо репортеров, таких как флуорофоры, с помощью методов оптического зондирования без меток. Для методов без меток иммобилизация элемента биоузнавания аналогична технике, основанной на метке. Любое прикрепление биомолекулы к поверхности этих датчиков изменяет показатель преломления в непосредственной близости от оптического устройства. Молекулы-мишени связываются с поверхностью функционализированного оптического устройства, образуя тонкий слой и дополнительно модифицируя показатель преломления. Эти изменения показателя преломления можно отслеживать, отслеживая изменение собственной частоты вибрации или резонансной частоты системы. Разница в резонансных частотах до и после привязки цели, называемая сдвигом f, прямо пропорциональна концентрации захваченной цели.
Теперь давайте рассмотрим основные принципы широко используемого метода оптического зондирования без меток — поверхностного плазмонного резонанса или SPR. Типичный SPR-прибор сочетает в себе подвижный лазерный источник, оптический детектор для измерения сдвига интенсивности и сенсорный чип со стеклянной призмой, покрытой с одной стороны золотом. Покрытая золотом призма интегрирована в жидкостную систему, обеспечивающую проточную работу. В эксперименте молекула зонда, или элемент биораспознавания, прикрепляется к поверхности золота. Затем целевой элемент течет по поверхности и связывается с иммобилизованным зондом. В зондировании используется феномен SPR. Это происходит, когда поляризованный свет проявляется на поверхности металла, например, золота, под определенным углом, тета-SPR. Это приводит к генерации поверхностных плазмонов, которые представляют собой когерентные электронные колебания, существующие на границе раздела двух материалов, имеющих диэлектрическую проницаемость противоположных знаков. При изменении массы, прикрепленной к поверхности сенсора, изменяется резонансное состояние поверхностных плазмонов. Следовательно, когда на поверхности привязан только элемент биоузнавания, луч отражается под одним углом, тета-первым. Затем, когда к поверхности прикрепляется большая масса, как к захваченной цели, наблюдается уменьшение интенсивности отраженного света под определенным углом, тета SPR, поскольку угол отражения изменяется на тета два. Изменение интенсивности отраженного света под резонансным углом, тета-SPR, является функцией угла отраженного света и может быть измерено как разница углов, тета один и тета два.
Теперь, когда мы рассмотрели принципы и процедуры, лежащие в основе оптических биосенсоров, давайте посмотрим, как исследователи применяют эти методы сегодня. Проточный клеточный цитометр представляет собой оптическую биосенсорную систему, которая обычно используется для подсчета клеток и измерения множества других клеточных свойств и компонентов. Образец, состоящий из нескольких типов клеток, каждый из которых помечен уникальным флуорофором, получают в суспензии. Затем образец пропускают через проточный цитометр таким образом, чтобы клетки проходили мимо лазерного луча по одной. Когда каждая клетка проходит через лазерный луч, рассеянный и испускаемый флуоресцентный свет различными флуорофорами количественно измеряется, что дает прямой подсчет различных типов клеток в образце. Еще одним применением оптических биосенсоров является обнаружение бактерий в образцах. Одним из способов сделать это является использование оптических кольцевых резонаторных датчиков. Они состоят из замкнутого контура, соединенного со световыми входными и выходными волноводами. Когда свет резонансной длины волны подается на входной волновод, он пропускается через петлю и накапливает интенсивность в течение нескольких круговых помолов из-за конструктивной интерференции и выводится на выходной волновод. Антитела, специфичные к поверхностным белкам бактерий, иммобилизуются на поверхности кольцевого резонатора и получают исходный спектр поглощения. Затем бактериальный образец подается на поверхность резонатора, чтобы обеспечить связывание бактерий с иммобилизованным телом, после чего получается второй спектр поглощения. Если интересующая бактерия связывается, наблюдается видимый сдвиг резонансных пиков, который прямо пропорционален концентрации целевых бактерий.
Вы только что посмотрели видео JoVE об оптическом биозондировании. Мы обсудили основные принципы оптического зондирования на основе меток и без меток, а также два ярких примера этих методов и некоторые области их применения. Спасибо за просмотр.
Оптические биосенсоры — это датчики, которые обнаруживают биологическую цель или интересующие цели с помощью света. Эти устройства нашли применение в здравоохранении, фармацевтике, мониторинге окружающей среды, национальной безопасности и даже на полях сражений. Оптические биосенсоры в целом делятся на датчики на основе меток и без меток. Примером зондирования на основе меток является полимеразная цепная реакция, или ПЦР, в которой используются флуоресцентные метки или флуорофоры для количественного определения амплифицированной целевой ДНК. Примером метода без меток является поверхностный плазмонный резонанс, или SPR. В этом случае взаимодействие неизмененных биомолекул с поверхностью сенсора количественно оценивается путем измерения фундаментальной характеристики сенсора, такой как угол отражения. В этом видео рассматриваются основы обоих типов методов оптической биосенсорной диагностики и ее критически важных компонентов, принципы работы и общие области применения оптических биосенсоров.
Во-первых, давайте рассмотрим общие принципы оптического биозондирования на основе меток. Как правило, зонд или элемент биораспознавания, такой как комплементарное антитело, прикрепляется к поверхности сенсора с помощью традиционной иммобилизационной химии. Затем раствор образца наносится на поверхность датчиков. Молекула-мишень, которая является комплементарной к иммобилизованному элементу биоузнавания, селективно захватывается из раствора сложного образца. Затем излишки раствора образца смываются буфером или водой. Затем, чтобы помочь визуализировать и количественно оценить количество связанной мишени, через систему пропускают вторичную молекулу, которая является комплементарной к мишени и прикреплена к флуорофору. Через некоторое время, когда произошло связывание вторичной молекулы с мишенью, избыток несвязанного флуорофора смывается. Затем интенсивность связанного флуорофора может быть количественно определена с помощью флуоресцентного микроскопа. Эта интенсивность сначала строится на график для различных известных концентраций целей для создания калибровочной кривой, которая затем позволяет напрямую измерить неизвестное количество захваченной цели. Таким образом, методы, основанные на метках, используют интенсивность флуоресценции чрезвычайно чувствительных флуорофоров для количественной оценки концентрации интересующей биомолекулы.
Теперь, когда мы рассмотрели принципы работы оптических биосенсоров на основе меток, давайте рассмотрим часто используемый пример — текущий стандарт амплификации ДНК, количественной ПЦР или количественной ПЦР. Реакционная смесь для количественной ПЦР включает в себя маркированный зонд для количественного определения реакции в режиме реального времени. Последовательность зонда прикрепляется как к молекулам флуоресцентного репортера, так и к молекуле гасителя и связывается с определенной последовательностью ДНК. Молекула гасителя гасит излучение флуорофора, в то время как оба они прикреплены к зонду. Во время ПЦР-реакции фермент полимераза разрушает ДНК зонда и физически отделяет флуорофорный репортер, тем самым предотвращая гашение и приводя к увеличению флуоресценции. Чтобы провести кПЦР, сначала добавьте все компоненты реакции, включая меченые зонды, в пробирку или лунку для ПЦР. Далее поместите лунки для ПЦР в специализированный амплификатор и введите параметры для каждого цикла и количество циклов. Амплификатор, используемый для количественной ПЦР, включает в себя источник света с необходимыми оптическими компонентами для выбора длины волны и детектор для измерения интенсивности флуоресценции в режиме реального времени во время реакции ПЦР. В конце каждого теплового цикла регистрируется и строится график интенсивности флуоресценции, обусловленной высвобождением флуорофоров. Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна логарифму целевой концентрации в реакционной лунке, и, таким образом, для известной флуоресценции можно рассчитать неизвестную целевую концентрацию.
Давайте теперь рассмотрим, как можно добиться сенсорного восприятия без каких-либо репортеров, таких как флуорофоры, с помощью методов оптического зондирования без меток. Для методов без меток иммобилизация элемента биоузнавания аналогична технике, основанной на метке. Любое прикрепление биомолекулы к поверхности этих датчиков изменяет показатель преломления в непосредственной близости от оптического устройства. Молекулы-мишени связываются с поверхностью функционализированного оптического устройства, образуя тонкий слой и дополнительно модифицируя показатель преломления. Эти изменения показателя преломления можно отслеживать, отслеживая изменение собственной частоты вибрации или резонансной частоты системы. Разница в резонансных частотах до и после привязки цели, называемая сдвигом f, прямо пропорциональна концентрации захваченной цели.
Теперь давайте рассмотрим основные принципы широко используемого метода оптического зондирования без меток — поверхностного плазмонного резонанса или SPR. Типичный SPR-прибор сочетает в себе подвижный лазерный источник, оптический детектор для измерения сдвига интенсивности и сенсорный чип со стеклянной призмой, покрытой с одной стороны золотом. Покрытая золотом призма интегрирована в жидкостную систему, обеспечивающую проточную работу. В эксперименте молекула зонда, или элемент биораспознавания, прикрепляется к поверхности золота. Затем целевой элемент течет по поверхности и связывается с иммобилизованным зондом. В зондировании используется феномен SPR. Это происходит, когда поляризованный свет проявляется на поверхности металла, например, золота, под определенным углом, тета-SPR. Это приводит к генерации поверхностных плазмонов, которые представляют собой когерентные электронные колебания, существующие на границе раздела двух материалов, имеющих диэлектрическую проницаемость противоположных знаков. При изменении массы, прикрепленной к поверхности сенсора, изменяется резонансное состояние поверхностных плазмонов. Следовательно, когда на поверхности привязан только элемент биоузнавания, луч отражается под одним углом, тета-первым. Затем, когда к поверхности прикрепляется большая масса, как к захваченной цели, наблюдается уменьшение интенсивности отраженного света под определенным углом, тета SPR, поскольку угол отражения изменяется на тета два. Изменение интенсивности отраженного света под резонансным углом, тета-SPR, является функцией угла отраженного света и может быть измерено как разница углов, тета один и тета два.
Теперь, когда мы рассмотрели принципы и процедуры, лежащие в основе оптических биосенсоров, давайте посмотрим, как исследователи применяют эти методы сегодня. Проточный клеточный цитометр представляет собой оптическую биосенсорную систему, которая обычно используется для подсчета клеток и измерения множества других клеточных свойств и компонентов. Образец, состоящий из нескольких типов клеток, каждый из которых помечен уникальным флуорофором, получают в суспензии. Затем образец пропускают через проточный цитометр таким образом, чтобы клетки проходили мимо лазерного луча по одной. Когда каждая клетка проходит через лазерный луч, рассеянный и испускаемый флуоресцентный свет различными флуорофорами количественно измеряется, что дает прямой подсчет различных типов клеток в образце. Еще одним применением оптических биосенсоров является обнаружение бактерий в образцах. Одним из способов сделать это является использование оптических кольцевых резонаторных датчиков. Они состоят из замкнутого контура, соединенного со световыми входными и выходными волноводами. Когда свет резонансной длины волны подается на входной волновод, он пропускается через петлю и накапливает интенсивность в течение нескольких круговых помолов из-за конструктивной интерференции и выводится на выходной волновод. Антитела, специфичные к поверхностным белкам бактерий, иммобилизуются на поверхности кольцевого резонатора и получают исходный спектр поглощения. Затем бактериальный образец подается на поверхность резонатора, чтобы обеспечить связывание бактерий с иммобилизованным телом, после чего получается второй спектр поглощения. Если интересующая бактерия связывается, наблюдается видимый сдвиг резонансных пиков, который прямо пропорционален концентрации целевых бактерий.
Вы только что посмотрели видео JoVE об оптическом биозондировании. Мы обсудили основные принципы оптического зондирования на основе меток и без меток, а также два ярких примера этих методов и некоторые области их применения. Спасибо за просмотр.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.