Оптическое биозондирование

Оптические биосенсоры — это датчики, которые обнаруживают биологическую цель или интересующие цели с помощью света. Эти устройства нашли применение в здравоохранении, фармацевтике, мониторинге окружающей среды, национальной безопасности и даже на полях сражений. Оптические биосенсоры в целом делятся на датчики на основе меток и без меток. Примером зондирования на основе меток является полимеразная цепная реакция, или ПЦР, в которой используются флуоресцентные метки или флуорофоры для количественного определения амплифицированной целевой ДНК. Примером метода без меток является поверхностный плазмонный резонанс, или SPR. В этом случае взаимодействие неизмененных биомолекул с поверхностью сенсора количественно оценивается путем измерения фундаментальной характеристики сенсора, такой как угол отражения. В этом видео рассматриваются основы обоих типов методов оптической биосенсорной диагностики и ее критически важных компонентов, принципы работы и общие области применения оптических биосенсоров.

Во-первых, давайте рассмотрим общие принципы оптического биозондирования на основе меток. Как правило, зонд или элемент биораспознавания, такой как комплементарное антитело, прикрепляется к поверхности сенсора с помощью традиционной иммобилизационной химии. Затем раствор образца наносится на поверхность датчиков. Молекула-мишень, которая является комплементарной к иммобилизованному элементу биоузнавания, селективно захватывается из раствора сложного образца. Затем излишки раствора образца смываются буфером или водой. Затем, чтобы помочь визуализировать и количественно оценить количество связанной мишени, через систему пропускают вторичную молекулу, которая является комплементарной к мишени и прикреплена к флуорофору. Через некоторое время, когда произошло связывание вторичной молекулы с мишенью, избыток несвязанного флуорофора смывается. Затем интенсивность связанного флуорофора может быть количественно определена с помощью флуоресцентного микроскопа. Эта интенсивность сначала строится на график для различных известных концентраций целей для создания калибровочной кривой, которая затем позволяет напрямую измерить неизвестное количество захваченной цели. Таким образом, методы, основанные на метках, используют интенсивность флуоресценции чрезвычайно чувствительных флуорофоров для количественной оценки концентрации интересующей биомолекулы.

Теперь, когда мы рассмотрели принципы работы оптических биосенсоров на основе меток, давайте рассмотрим часто используемый пример — текущий стандарт амплификации ДНК, количественной ПЦР или количественной ПЦР. Реакционная смесь для количественной ПЦР включает в себя маркированный зонд для количественного определения реакции в режиме реального времени. Последовательность зонда прикрепляется как к молекулам флуоресцентного репортера, так и к молекуле гасителя и связывается с определенной последовательностью ДНК. Молекула гасителя гасит излучение флуорофора, в то время как оба они прикреплены к зонду. Во время ПЦР-реакции фермент полимераза разрушает ДНК зонда и физически отделяет флуорофорный репортер, тем самым предотвращая гашение и приводя к увеличению флуоресценции. Чтобы провести кПЦР, сначала добавьте все компоненты реакции, включая меченые зонды, в пробирку или лунку для ПЦР. Далее поместите лунки для ПЦР в специализированный амплификатор и введите параметры для каждого цикла и количество циклов. Амплификатор, используемый для количественной ПЦР, включает в себя источник света с необходимыми оптическими компонентами для выбора длины волны и детектор для измерения интенсивности флуоресценции в режиме реального времени во время реакции ПЦР. В конце каждого теплового цикла регистрируется и строится график интенсивности флуоресценции, обусловленной высвобождением флуорофоров. Интенсивность флуоресценции прямо пропорциональна логарифму целевой концентрации в реакционной лунке, и, таким образом, для известной флуоресценции можно рассчитать неизвестную целевую концентрацию.

Давайте теперь рассмотрим, как можно добиться сенсорного восприятия без каких-либо репортеров, таких как флуорофоры, с помощью методов оптического зондирования без меток. Для методов без меток иммобилизация элемента биоузнавания аналогична технике, основанной на метке. Любое прикрепление биомолекулы к поверхности этих датчиков изменяет показатель преломления в непосредственной близости от оптического устройства. Молекулы-мишени связываются с поверхностью функционализированного оптического устройства, образуя тонкий слой и дополнительно модифицируя показатель преломления. Эти изменения показателя преломления можно отслеживать, отслеживая изменение собственной частоты вибрации или резонансной частоты системы. Разница в резонансных частотах до и после привязки цели, называемая сдвигом f, прямо пропорциональна концентрации захваченной цели.

Теперь давайте рассмотрим основные принципы широко используемого метода оптического зондирования без меток — поверхностного плазмонного резонанса или SPR. Типичный SPR-прибор сочетает в себе подвижный лазерный источник, оптический детектор для измерения сдвига интенсивности и сенсорный чип со стеклянной призмой, покрытой с одной стороны золотом. Покрытая золотом призма интегрирована в жидкостную систему, обеспечивающую проточную работу. В эксперименте молекула зонда, или элемент биораспознавания, прикрепляется к поверхности золота. Затем целевой элемент течет по поверхности и связывается с иммобилизованным зондом. В зондировании используется феномен SPR. Это происходит, когда поляризованный свет проявляется на поверхности металла, например, золота, под определенным углом, тета-SPR. Это приводит к генерации поверхностных плазмонов, которые представляют собой когерентные электронные колебания, существующие на границе раздела двух материалов, имеющих диэлектрическую проницаемость противоположных знаков. При изменении массы, прикрепленной к поверхности сенсора, изменяется резонансное состояние поверхностных плазмонов. Следовательно, когда на поверхности привязан только элемент биоузнавания, луч отражается под одним углом, тета-первым. Затем, когда к поверхности прикрепляется большая масса, как к захваченной цели, наблюдается уменьшение интенсивности отраженного света под определенным углом, тета SPR, поскольку угол отражения изменяется на тета два. Изменение интенсивности отраженного света под резонансным углом, тета-SPR, является функцией угла отраженного света и может быть измерено как разница углов, тета один и тета два.

Теперь, когда мы рассмотрели принципы и процедуры, лежащие в основе оптических биосенсоров, давайте посмотрим, как исследователи применяют эти методы сегодня. Проточный клеточный цитометр представляет собой оптическую биосенсорную систему, которая обычно используется для подсчета клеток и измерения множества других клеточных свойств и компонентов. Образец, состоящий из нескольких типов клеток, каждый из которых помечен уникальным флуорофором, получают в суспензии. Затем образец пропускают через проточный цитометр таким образом, чтобы клетки проходили мимо лазерного луча по одной. Когда каждая клетка проходит через лазерный луч, рассеянный и испускаемый флуоресцентный свет различными флуорофорами количественно измеряется, что дает прямой подсчет различных типов клеток в образце. Еще одним применением оптических биосенсоров является обнаружение бактерий в образцах. Одним из способов сделать это является использование оптических кольцевых резонаторных датчиков. Они состоят из замкнутого контура, соединенного со световыми входными и выходными волноводами. Когда свет резонансной длины волны подается на входной волновод, он пропускается через петлю и накапливает интенсивность в течение нескольких круговых помолов из-за конструктивной интерференции и выводится на выходной волновод. Антитела, специфичные к поверхностным белкам бактерий, иммобилизуются на поверхности кольцевого резонатора и получают исходный спектр поглощения. Затем бактериальный образец подается на поверхность резонатора, чтобы обеспечить связывание бактерий с иммобилизованным телом, после чего получается второй спектр поглощения. Если интересующая бактерия связывается, наблюдается видимый сдвиг резонансных пиков, который прямо пропорционален концентрации целевых бактерий.

Вы только что посмотрели видео JoVE об оптическом биозондировании. Мы обсудили основные принципы оптического зондирования на основе меток и без меток, а также два ярких примера этих методов и некоторые области их применения. Спасибо за просмотр.