Цифровая ПЦР для количественного определения циркулирующих микроРНК в острый инфаркт миокарда и сердечно-сосудистых заболеваний
3 июля 2018 г.
Циркулирующих микроРНК показали обещание качестве биомаркеров для сердечно-сосудистых заболеваний и острого инфаркта миокарда. В этом исследовании мы описываем протокол для извлечения Мирна, обратной транскрипции и цифровой ПЦР для количественной оценки абсолютной интерферирующим в сыворотке крови больных с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностики, например, являются ли микроРНК действительными биомаркерами сердечно-сосудистых заболеваний. По сравнению с количественной ПЦР в реальном времени, цифровая ПЦР обладает превосходными техническими характеристиками для количественного определения микроРНК в циркуляции. Поскольку образец разделен примерно на 20 000 капель, нет необходимости в повторных измерениях, а также в стандартной кривой для количественной оценки.
Хотя этот метод может дать представление о количественной оценке микроРНК у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, он также может быть применен к другим пациентам и заболеваниям, поскольку другие микроРНК показали многообещающие результаты в качестве биомаркеров прогрессирования рака, он также может быть применен к онкологическим пациентам. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что образующиеся капли хрупкие и с ними нужно обращаться осторожно. После выделения РНК из образцов сыворотки продолжайте обратную транскрипцию для получения более стабильной комплементарной ДНК для дПЦР.
Для начала разморозьте набор для обратной транскрипции на льду. Затем прижмите ферменты и праймеры вниз. Далее приготовьте мастер-микс, как описано в текстовом протоколе.
Соедините 10 микролитров мастер-смеси с пятью микролитрами экстрагированной РНК в каждой лунке 96-луночного планшета. Затем центрифугируйте планшет при температуре 2000xg при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. Продолжайте обратную транскрипцию, как описано в текстовом протоколе.
Во-первых, разморозьте коммерческую смесь дПЦР, кДНК и праймеры ПЦР на льду и центрифуге непосредственно перед использованием. Затем приготовьте мастер-микс, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 1,33 микролитра объема продукта обратной транскрипции к 18,67 микролитрам мастер-смеси и быстро центрифугируйте.
С помощью пипетки переведите по 20 микролитров образца в каждую лунку среднего ряда восьмилуночной кассеты. Затем пиппетка закачивает 70 микролитров капли-генерации масла в масляные скважины кассеты. Далее поместите прокладку на верхнюю часть кассеты и поместите ее в каплегенератор.
Закройте каплегенератор и подождите, пока три индикатора не загорятся зеленым цветом. С помощью пипетки осторожно переложите 40 микролитров образовавшейся в каплю образца в отдельные лунки 96-луночного планшета. Затем запечатайте планшет фольгой dPCR при температуре 180 градусов Цельсия на четыре секунды.
Поместите запечатанную ПЦР-пластину в амплификатор и следуйте инструкциям по велоспорту, изложенным в текстовом протоколе. Снимите пластину с термоамплификатора и перенесите ее на основание держателя тарелки. Затем поместите верхнюю часть держателя планшета на планшет для ПЦР.
Наконец, запустите коммерческое программное обеспечение dPCR. В этом протоколе цифровая ПЦР использовалась для количественного определения микроРНК в сыворотке крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Образцы были взяты у 16 пациентов до, через восемь часов после и через 16 часов после чрескожного вмешательства.
У пациентов с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST наблюдалось достоверное повышение уровня miR-499 по сравнению с пациентами со стабильной ишемической болезнью сердца. После освоения эта техника может быть выполнена примерно за час для формирования капель из 96 образцов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с каплями.
После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как правильно выполнять цифровую ПЦР, путем правильного формирования капель, циклирования, чтения и анализа.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном исследовании представлен протокол экстракции и количественного определения циркулирующих микроРНК в качестве потенциальных биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний. Использование цифровой ПЦР в данном методе направлено на повышение точности измерения уровня микроРНК в образцах сыворотки крови пациентов с сердечно-сосудистыми патологиями.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Сердечно-сосудистые заболевания
- Биомаркеры
- Анализ микроРНК
Теоретические основы
- МикроРНК представляют собой малые некодирующие РНК, участвующие в регуляции экспрессии генов.
- Они стали рассматриваться как потенциальные биомаркеры различных заболеваний, включая сердечно-сосудистые патологии.
- Цифровая ПЦР обладает рядом преимуществ перед традиционными методами количественного определения микроРНК.
- Понимание профилей микроРНК может помочь в диагностике и лечении сердечно-сосудистых заболеваний.
Цель исследования
- Валидация микроРНК в качестве биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний.
- Демонстрация эффективности цифровой ПЦР для количественного определения циркулирующих микроРНК.
- Предоставление надежного протокола для исследователей в данной области.
Используемые методы
- Выделение микроРНК из образцов сыворотки крови.
- Обратная транскрипция для синтеза комплементарной ДНК.
- Цифровая ПЦР для абсолютного количественного определения микроРНК.
- Сравнение цифровой ПЦР с количественной ПЦР в реальном времени.
Основные результаты
- Цифровая ПЦР продемонстрировала более высокую точность количественного определения miRNA.
- Метод позволяет анализировать тысячи капель без необходимости построения стандартных кривых.
- Потенциальная применимость метода выходит за рамки сердечно-сосудистых заболеваний и распространяется на другие патологии, такие как рак.
- Для новых пользователей метода были отмечены сложности в работе с хрупкими каплями.
Выводы
- Данное исследование подтверждает возможность использования циркулирующих микроРНК в качестве биомаркеров сердечно-сосудистых заболеваний.
- Цифровая ПЦР является перспективным инструментом для точного количественного определения микроРНК.
- Дальнейшие исследования могут расширить применение этого метода для диагностики других заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Количественное определение циркулирующих микроРНК с помощью цифровой ПЦР обеспечивает воспроизводимый и высокочувствительный подход к валидации биомаркеров в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний. Данный метод поддерживает валидацию мишеней и разработку анализов, обеспечивая абсолютный количественный учет без использования стандартных кривых, что снижает вариабельность в многоцентровых исследованиях. Этот метод повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска, связывая экспрессию микроРНК с патологией, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейших исследований при проверке терапевтических гипотез.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное обнаружение и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного определения специфических для заболевания микроРНК, таких как miR-499 при остром инфаркте миокарда (ОИМ).
- Практическая ценность: обеспечивает определение абсолютного количества копий микроРНК без использования стандартных кривых, что повышает воспроизводимость результатов в разных центрах.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля биомаркеров путем установления связи между уровнями микроРНК и сердечно-сосудистой патологией.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет создавать валидированные биологические системы (кДНК из РНК сыворотки) для последующих этапов скрининга.
- Практическая ценность: обеспечивает высокую линейность и низкую вариабельность результатов, что подходит для стандартизации анализа.
- Масштабируемость: позволяет обрабатывать 96 образцов примерно за один час после приготовления основного раствора, поддерживая скрининг со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между количественным определением miRNA на этапе открытия и доклинической валидацией с помощью релевантных для заболевания сывороточных биомаркеров.
- Механистическое снижение рисков: уменьшает неопределенность при валидации мишеней путем корреляции экспрессии miRNA с повреждением сердечно-сосудистой системы.
- Согласованность биомаркеров: способствует разработке трансляционных биомаркеров за счет количественного определения miRNA с высокой тканевой и заболевание-специфичностью.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум исследований от проверки гипотез до идентификации ведущих соединений, предоставляя количественные данные о miRNA, которые позволяют оценить достоверность мишени и готовность анализа.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез путем количественного определения высвобождения miRNA из сердечно-сосудистых клеток в кровоток.
- Скрининг: Обеспечивает получение стандартизированных результатов, готовых к анализу, с высокой чувствительностью для оценки потенциальных биомаркеров.
- Аналитика: Позволяет проводить прямое сравнение уровней miRNA при различных условиях, используя абсолютное количественное определение без применения стандартных кривых.
- Трансляционные исследования: Способствует преемственности биомаркеров, связывая профили циркулирующих miRNA с сердечно-сосудистой патологией.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу количественного анализа, применимую для сердечно-сосудистых и онкологических показаний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность валидности биомаркеров за счет количественного определения miRNA с низкой вариабельностью и высокой чувствительностью.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию за счет разделения на капли, что исключает необходимость в повторных измерениях.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшего продолжения исследований («go/no-go») за счет снижения механистической неоднозначности в отношениях между биомаркером и мишенью.
- Влияние на портфель проектов: позволяет осуществлять развитие с учетом рисков на основе количественных данных о miRNA, связанных с патологией.
Особенности внедрения
- Требуется опыт в области выделения РНК, обратной транскрипции и работы с каплями для предотвращения потерь образца.
- Необходимо наличие оборудования для генерации капель, ПЦР-амплификаторов и программного обеспечения для dPCR для точного количественного определения.
- Требуется стандартизация протоколов формирования и герметизации капель между исследовательскими группами для получения воспроизводимых результатов.
- При применении к различным типам образцов, помимо сыворотки (например, к плазме или лизатам тканей), требуются соответствующие адаптации метода.
- Существуют практические ограничения, такие как осторожное обращение с хрупкими каплями, что может повлиять на пропускную способность при работе с неопытными пользователями.
