Цифровая ПЦР для количественного определения циркулирующих микроРНК в острый инфаркт миокарда и сердечно-сосудистых заболеваний

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области диагностики, например, являются ли микроРНК действительными биомаркерами сердечно-сосудистых заболеваний. По сравнению с количественной ПЦР в реальном времени, цифровая ПЦР обладает превосходными техническими характеристиками для количественного определения микроРНК в циркуляции. Поскольку образец разделен примерно на 20 000 капель, нет необходимости в повторных измерениях, а также в стандартной кривой для количественной оценки.

Хотя этот метод может дать представление о количественной оценке микроРНК у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями, он также может быть применен к другим пациентам и заболеваниям, поскольку другие микроРНК показали многообещающие результаты в качестве биомаркеров прогрессирования рака, он также может быть применен к онкологическим пациентам. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что образующиеся капли хрупкие и с ними нужно обращаться осторожно. После выделения РНК из образцов сыворотки продолжайте обратную транскрипцию для получения более стабильной комплементарной ДНК для дПЦР.

Для начала разморозьте набор для обратной транскрипции на льду. Затем прижмите ферменты и праймеры вниз. Далее приготовьте мастер-микс, как описано в текстовом протоколе.

Соедините 10 микролитров мастер-смеси с пятью микролитрами экстрагированной РНК в каждой лунке 96-луночного планшета. Затем центрифугируйте планшет при температуре 2000xg при четырех градусах Цельсия в течение двух минут. Продолжайте обратную транскрипцию, как описано в текстовом протоколе.

Во-первых, разморозьте коммерческую смесь дПЦР, кДНК и праймеры ПЦР на льду и центрифуге непосредственно перед использованием. Затем приготовьте мастер-микс, как описано в текстовом протоколе. Добавьте 1,33 микролитра объема продукта обратной транскрипции к 18,67 микролитрам мастер-смеси и быстро центрифугируйте.

С помощью пипетки переведите по 20 микролитров образца в каждую лунку среднего ряда восьмилуночной кассеты. Затем пиппетка закачивает 70 микролитров капли-генерации масла в масляные скважины кассеты. Далее поместите прокладку на верхнюю часть кассеты и поместите ее в каплегенератор.

Закройте каплегенератор и подождите, пока три индикатора не загорятся зеленым цветом. С помощью пипетки осторожно переложите 40 микролитров образовавшейся в каплю образца в отдельные лунки 96-луночного планшета. Затем запечатайте планшет фольгой dPCR при температуре 180 градусов Цельсия на четыре секунды.

Поместите запечатанную ПЦР-пластину в амплификатор и следуйте инструкциям по велоспорту, изложенным в текстовом протоколе. Снимите пластину с термоамплификатора и перенесите ее на основание держателя тарелки. Затем поместите верхнюю часть держателя планшета на планшет для ПЦР.

Наконец, запустите коммерческое программное обеспечение dPCR. В этом протоколе цифровая ПЦР использовалась для количественного определения микроРНК в сыворотке крови пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Образцы были взяты у 16 пациентов до, через восемь часов после и через 16 часов после чрескожного вмешательства.

У пациентов с инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST наблюдалось достоверное повышение уровня miR-499 по сравнению с пациентами со стабильной ишемической болезнью сердца. После освоения эта техника может быть выполнена примерно за час для формирования капель из 96 образцов, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с каплями.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как правильно выполнять цифровую ПЦР, путем правильного формирования капель, циклирования, чтения и анализа.