Изоляция предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранившихся

Здесь мы описываем оптимизированный, основанные на Langendorff процедура для изоляции одноклеточных предсердий кардиомиоцитов из крыса модели метаболических связанных с синдром сердечной недостаточности с фракция изгнания сохранились. Ручного регулирования давления внутрипросветная полостей сердца реализуется, чтобы принести функционально нетронутым миоцитах подходит для возбуждения сужение муфта исследований.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области функции отдельных кардиомиоцитов и позволяет изучить возбуждение-сокращение-связь. Основное преимущество данной методики заключается в том, что можно выделить высокий выход жизнеспособных предсердных кардиомиоцитов из сердец с кардиомиопатией предсердий и использовать их для последующих экспериментов. Начните с установки канюли с длинным острым наконечником на верхнюю часть аппарата Лангендорфа и запустите поток.

Включите нагревательный модуль и отрегулируйте так, чтобы буфер для перфузии на кончике иглы поддерживал нужную температуру для перфузии. После завершения калибровки температуры переложите канюлю в шприц объемом 10 мл, наполненный ледяным буфером для канюляции. Поместите два готовых двойных верхних узла над канюлей для быстрой последующей канюляции аорты.

Извлеките сердце у усыпленной, гепаринизированной крысы, зажав основание сердца щипцами и осторожно потянув вниз по направлению к хвосту животного. Разрежьте аорту, сохраняя при этом натяжение сердца, оставив сегмент аорты длиной 5 мм, прикрепленный к сердцу. Быстро переведите сердце в 50 мл ледяного канюляционного буфера в стакане объемом 50 мл.

Подождите примерно 10 секунд, пока сердце остынет и прекратит сокращения. Затем перенесите сердце в чашку Петри, содержащую 50 мл свежего, ледяного буфера для канюляции, и осторожно удалите жировые ткани, окружающие аорту, с помощью щипцов и ножниц. Вставьте модифицированную канюлю на 3 мм в аорту, не повреждая аортальный клапан.

Закрепите аорту на канюле, завязав один из двух узлов канюляции в углублении, проксимальном к кончику канюли. Завяжите второй канюляционный узел в углублении дистальнее кончика канюли. Аккуратно промойте аорту 5 мл ледяного канюляционного буфера с помощью шприца, прикрепленного к канюле, до тех пор, пока в коронарных артериях не исчезнет видимость крови.

Затем с помощью щипцов мягко массируйте левое предсердие, вводя оставшиеся 5 мл канюляционного буфера, чтобы смыть оставшуюся кровь. Отсоедините канюлю с прикрепленным сердцем от шприца. Установите канюлю с прикрепленным сердцем к Лангендорфу с помощью соответствующего адаптера.

Запустите перистальтический насос аппарата Лангендорфа, чтобы инициировать перфузию сердечной ткани. Быстро завяжите двойной верхний узел вокруг основания сердца, исключая аорту. Когда правое и левое предсердия и коронарный синус надуваются, проколите предсердие иглой-бабочкой устройства контроля давления и дайте предсердию сдуться.

Управляйте внутрипросветным давлением предсердий, регулируя высоту шланга, прикрепленного к игле бабочки. Держите предсердие слегка надутым на протяжении всей оставшейся части процедуры. Крайне важно, чтобы этот шаг был выполнен быстро, так как длительное раздувание предсердий приведет к гибели кардиомиоцитов.

Поместите температурный зонд между левым предсердием и левым желудочком, чтобы измерить приблизительную температуру левого предсердия. Отрегулируйте температуру нагревательного модуля Langendorff соответствующим образом, ориентируясь на приблизительную температуру левого предсердия в 37 °C. После 3 минут перфузии с перфузионным буфером переключитесь на буфер для разложения и перфузируйте примерно 14-18 минут.

Когда структура левого предсердия разрушается и ткань приобретает молочную текстуру, защемите предсердие с помощью щипцов и акта легкого натяжения. Удалите левое предсердие с помощью тонких ножниц и переложите предсердие в большую весовую лодку, содержащую 2 мл стопорного буфера, полностью погрузив ткани. С помощью тонких ножниц измельчите ткань предсердий на мелкие кусочки площадью примерно 2 кв. мм.

Диспергируйте ткань, осторожно растирая ткань с помощью пипетки для переноса в течение примерно 5 минут, пока не будет наблюдаться макроскопическая диссоциация ткани. Избегайте образования пузырьков воздуха, так как воздействие воздуха на клетки приведет к гибели кардиомиоцитов. Затем перенесите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.

Дав кусочкам ткани осесть в течение 30 с, удалите надосадочную жидкость и переложите в другую коническую пробирку объемом 15 мл. Затем дайте ячейкам отстояться в течение 15 минут. После удаления и выброса надосадочной жидкости добавьте 2 мл буфера Step 1 и дайте кардиомиоцитам осесть в течение 10 минут.

Через 10 минут удалите и выбросьте последнюю надосадочную жидкость. Добавьте 250 микролитров обычного тирода, содержащего 1 мМ кальция. Перелейте 50 микролитров суспензии предсердных кардиомиоцитов на стеклянную посуду с покрытием из ламинина и дайте кардиомиоцитам отстояться при комнатной температуре в течение 10 минут.

Через 10 минут добавьте в клетки 500 микролитров обычного Тайрода, содержащего 1 мМ хлорида кальция. Оцените морфологию и жизнеспособность клеток под световым микроскопом. Случайным образом выберите около 100 клеток и классифицируйте их как жизнеспособные или нежизнеспособные, чтобы оценить жизнеспособность процедуры выделения клеток.

Жизнеспособные клетки характеризуются симметричной саркомерной структурой, отсутствием мембранных пузырьков и палочковидной формой. Добавьте 10 микромоляров Fluo-4-AM к 500 микролитрам обычного Tyrode и используйте его для замены обычного Tyrode, содержащего 1 мМ хлорида кальция в стеклянной нижней чашке. Через 20 мин удалите раствор Fluo-4-AM и дважды промойте клетки 500 микролитрами обычного Тирода.

Перенесите чашку в конфокальный микроскоп и визуализируйте возбуждение кальция, используя 40-кратное увеличение. Затем перфузируйте клетки обычным Тайродом, нагретым до 37 С, с помощью соответствующего суперфузионного устройства. Стимулируйте кардиомиоциты в электрическом поле с помощью коммерчески доступных электродов-стимуляторов, установленных под микроскопом, с частотой 1 Гц и электрическим током 24 ампера.

Подождав 1 минуту, чтобы клетки достигли устойчивого состояния обработки ионов кальция, получите изображения линейного сканирования путем повторного сканирования. На этом изображении показано поперечное линейное сканирование одного кардиомиоцита. Изменение концентрации цитозольного кальция показано при возбуждении чувствительного к кальцию флуоресцентного красителя Fluo-4-AM.

Стрелки указывают на электрическую стимуляцию, проводимую с частотой 1 Гц. На этом изображении показаны поперечные переходные процессы кальция, полученные из этой отдельной клетки. После освоения этой техники ее можно выполнить за 3 часа. При использовании этого протокола важно помнить о чувствительности ко времени определенных этапов процедуры изоляции.

После этой процедуры могут быть выполнены другие методы субклеточной визуализации, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся ремоделирования кардиомиоцитов предсердий.