Культура тканей всего органа

Культуры in vitro частичных или целых органов часто используются для точного моделирования функций тканей и органов в различных условиях испытаний. Культивирование всего органа может включать в себя децеллюляризацию иссеченного органа или удаление клеток с целью использования нативной структуры органа. Далее следует рецеллюляризация новыми клетками. Использование специализированных биореакторов часто включается в процесс рецеллюляризации для имитации роста тканей в организме. В этом видео будут представлены основные принципы культивирования тканей всего органа и продемонстрирована процедура в лаборатории.

Этот процесс начинается с забора донорского органа. В этом примере мы показываем донорское легкое от обезьяны. С помощью процесса, называемого детергентной перфузией, изолированный орган систематически очищается от своей нативной клеточной популяции с помощью серии промывок, в результате чего образуется стерильная бесклеточная матрица органа. Затем тканевый матрикс рецеллюляризуется с использованием определенных типов клеток, таких как установленная линия стволовых клеток. Клетки также могут быть пожертвованы человеком, который получает искусственную ткань, что называется трансплантацией аутологичных клеток. Это смягчает отторжение и повышает биосовместимость органа. В качестве альтернативы можно использовать клетки от другого донора, что называется аллогенной трансплантацией. Это может потребоваться в том случае, если у потенциального реципиента не может быть получено достаточное количество клеток. После того, как клетки засеяны на органе, тканевые биореакторы используются для стимуляции пролиферации клеток и прямого роста тканей. Эти реакторы нацелены на динамическое культивирование органа и имитацию естественной среды, обнаруженной in vivo. Например, орган может быть подключен к перистальтическому насосу для того, чтобы имитировать кровоток. Теперь, когда вы узнали об основах культивирования органов, давайте рассмотрим пример процедуры, включающей всю культуру органов донорских легких.

Для начала донорские легкие помещают в лоток для препарирования, а легочную артерию канюлируют путем введения в открытую полость женского люэровского коннектора. Затем в отверстие трахеи вставляется второй соединитель Люэра с внутренней резьбой. Затем вводится фосфатно-солевой буфер или PBS, содержащий 30 единиц на миллилитр гепарина и 5 микрограммов на миллилитр нитропруссида натрия, чтобы облегчить расширение кровеносных сосудов и удаление захваченного воздуха из легких. Раствор выталкивается за счет естественной отдачи и повторяется еще дважды перед закрытием канюли, чтобы удерживать раствор в легких и растворять остаточную кровь. Затем оба предсердия разрываются, и колпачок канюли Люэра удаляется для облегчения оттока жидкости. Перфузия продолжается с помощью PBS, гепарина и раствора нитропруссида натрия до тех пор, пока из легочной сосудистой сети не будет удалено как можно больше крови. Чтобы начать децеллюризацию, легкие надуваются и пропитываются деионизированной водой. После пяти артериальных и сосудистых промываний легкие извлекаются из воды и погружаются в моющее средство под названием Triton для удаления клеток при минимальном воздействии на матрикс органа. Легкие надувают еще дважды раствором Тритона перед инкубацией в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации легкие еще пять раз промывают пресной деионизированной водой. Затем легкие погружают в 2% раствор дезоксихолата натрия, а затем еще несколько раз промывают водой и буферным раствором, чтобы облегчить децеллюляризацию и удаление клеточного мусора. При полном очищении орган хранится в стерильном растворе PBS при температуре четыре градуса Цельсия до момента использования.

Чтобы имитировать естественное поведение легких, можно использовать специализированный биореактор, подобный показанному здесь. Во-первых, основная камера реактора заполняется питательной средой, которая была уравновешена до 5% углекислого газа в атмосфере. Затем устанавливается орган. После подключения крышка защелкивается, и весь воздух удаляется из трубки с помощью шприца. Затем биореактор перемещают в инкубатор для тканевых культур для балансировки. Затем легкие вентилируются примерно с одним полным вдохом каждые две минуты, и среда циркулирует по сосудистой сети через перистальтический насос со скоростью примерно 10 миллилитров в минуту в общей сложности 30 минут.

Для посева через дыхательные пути легкие надувают клеточной суспензией, содержащей мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга. Для рецеллюляризации альвеол, которые отвечают за газообмен кислорода и углекислого газа, происходящий в легких. Затем легкие инкубируются в течение ночи, чтобы позволить клеткам прикрепиться к децеллюляризованному матриксу. После ночной инкубации вентиляция возобновляется, и клеткам дают расти в матриксе органа в течение нескольких дней. Затем сосудистый посев завершается постепенным введением эндотелиальных клеток с помощью перистальтического насоса для инициирования рецеллюляризации мелких сосудов, а затем статически культивируется в течение нескольких часов, чтобы способствовать развитию клеточного органа. Культуральную среду снова циркулируют, и клетки культивируют в течение недели для стимулирования роста и прикрепления в динамических условиях. После того, как рост тканей завершен, проводится гистология для подтверждения прикрепления и роста как мезенхимальных стволовых клеток, так и эндотелиальных клеток в сосудистой сети и дыхательных путях органа. Гистология показывает прикрепление мезенхимальных стволовых клеток и эндотелиальных клеток к альвеолам в пределах каркаса матрикса и мелких сосудистых сосудов, создавая видимость нативной легочной ткани.

Теперь, когда вы узнали о культуре целых органов, давайте рассмотрим некоторые практические применения этой технологии за пределами основного направления регенеративной медицины и замены органов. Культура целого органа также может быть использована в качестве способа тестирования фармацевтических агентов или устройств для доставки лекарств. Например, в этом исследовании эмбриональные щитовидные железы мышей были эксплантированы, культивированы и использованы в качестве модели органа для наблюдения за тем, как экспериментальные фармацевтические агенты транспортируются через орган и ткани. Это моделирование может в конечном итоге привести к более реалистичному представлению о том, как лекарство передается в органе in vivo. Наконец, культура тканей всего органа может быть использована для изучения поведения тканей в различных условиях. Например, межпозвоночные диски были извлечены из хвостов крупного рогатого скота для изучения возможных механизмов дегенерации дисков. Специально разработанные биореакторы были использованы для индуцирования механической нагрузки на диск, чтобы лучше понять, как эти нагрузки влияют на дегенерацию.

Вы только что посмотрели видео Джоува о культуре тканей целых органов. Теперь вы должны понять, как целые органы могут быть культивированы in vitro и как эта техника применяется в области биоинженерии. Спасибо за просмотр.