Характеристика MLKL-опосредованной плазматической мембраны разрыв в Necroptosis

Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы о роли псевдокиназы со смешанной линией киназного домена или MLKL в некроптозе, таких как мембранная транслокация и пермеабилизация в связывании липидов. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они напрямую вовлекают MLKL в роль исполнителя разрыва плазматической мембраны при некроптозе. Визуализация живых клеток произвела революцию в области исследований клеточной смерти, особенно MLKL-опосредованного некроптоза.

Ядерный магнитный резонанс является мощным методом мониторинга связывания липидов с белками, как показано здесь для MLKL. Начните с нанесения 5 раз по 10 до четвертой нокаутирующей мышиной эмбриональных фибробластов или MEF, экспрессирующих исполнительный домен MLKL, слитых с олигомеризационной кассетой, и Venus в одном миллилитре дополненного DMEM в 24-луночных планшетах для их ночной инкубации в инкубаторе для клеточных культур. На следующее утро обрабатывайте клетки доксициклином в течение 12 часов, чтобы вызвать экспрессию трансгена, с последующим добавлением стандартного DMEM, дополненного димеризатором, связывающим FK506, и непроницаемым для мембран зеленым флуоресцентным красителем для индуцирования некроптоза.

Чтобы контролировать гибель клеток, поместите планшет в соответствующий блок визуализации, расположенный в инкубаторе для культуры тканей млекопитающих, и откройте программное обеспечение системы визуализации. Выберите вкладку «Запланировать предстоящие сканирования» и выберите лоток, сосуд, типы сканирования и шаблон сканирования на вкладке «Физическая схема». Выберите быструю флуоресценцию на вкладке Свойства и щелкните окно Временная шкала и укажите общее количество временных точек и частоту сканирования, чтобы добавить время сканирования.

Затем нажмите «Применить», чтобы начать получение изображения. Чтобы количественно оценить некроптоз, выберите панель «Задачи» и наведите курсор мыши на фон нескольких изображений, чтобы задать новый анализ подсчета объектов с фиксированным порогом сегментации выше уровня фона. Затем выберите «Предварительный просмотр», чтобы изучить флуоресцентные объекты на текущем изображении и при необходимости уточнить пороговые уровни.

Тщательный выбор порогового значения может быть выполнен путем наблюдения за несколькими скважинами на планшете и с помощью функции предварительного просмотра в программном обеспечении. Просто имейте в виду, что нужно использовать одну и ту же настройку порога для всех скважин в пластине. Чтобы интегрировать зеленые счетчики флуоресценции, на вкладке Запустить новый анализ выберите временной диапазон и скважины для анализа, а также введите имя задания анализа.

Затем нажмите кнопку «ОК» и дважды щелкните имя задания, чтобы экспортировать данные для дополнительного анализа в соответствующую программу для построения графиков. Для связывания липидов MLKL с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса или ЯМР используйте герметичные шприцы, чтобы распределить один миллиграмм на миллилитр интересующих фосфолипидов в чистые стеклянные флаконы для отдельных серий титрования ЯМР и поместить флаконы под газообразный поток аргона или азота на 5-30 минут. Диспенсирование липидов из летучих растворителей, таких как хлороформ или метанол, должно выполняться быстро из складов, хранящихся на сухом льду, чтобы свести к минимуму несоответствия в концентрациях липидов между образцами из-за испарения растворителя.

В конце периода испарения с помощью большого пинцета расположите флаконы на дне колбы Бюхнера. Закройте колбу резиновой пробкой и прикрепите пластиковую трубку, подключенную к вакуумной линии, чтобы откачать содержимое флакона под слабым вакуумом на ночь, чтобы удалить остатки органики. На следующее утро добавьте ЯМР-буфер, дополненный моющим средством в соответствующей экспериментальной концентрации, в каждый стеклянный флакон с липидной пленкой и произведите ультразвуковую обработку флакона на водяной бане на срок до 30 минут, останавливая ультразвуковую обработку каждые 10 минут, чтобы проверить солюбилизацию липидной пленки.

В конце ультразвуковой обработки дайте флаконам остыть в течение 15 минут и выполните последовательное разбавление липидно-моющих мицелл в ЯМР-буфере с положительным детергентом, обрабатывая смеси 1:1 для желаемого ряда концентраций. Подготовить контрольные и референсные образцы ЯМР белка и добавок в ЯМР-отрицательных и детергентно-положительных ЯМР-буферах соответственно, добавляя белок и добавки к каждому разведению липидов в детергентно-положительном буфере. Затем перенесите соответствующий объем образцов в ЯМР-пробирки подходящего размера и загрузите образцы в ЯМР-прибор.

Полный некроптоз MLKL-нокаутных MEF может наблюдаться в течение одного часа после димер-олигомеризации доксициклиновых преинкубированных клеток, экспрессирующих слитый трансген. Этот быстрый кинетический некроптоз поддерживает роль MLKL в качестве предполагаемого исполнителя разрыва плазматической мембраны, что приводит к образованию плазматической мембраны Venus puncta в течение одной-двух минут лечения с кодированием димера и Венеры на клеточной периферии и постепенном округлении клеток в течение двух-трех минут. При быстром некроптозе клетки изменяют морфологию от своей нормальной удлиненной формы к округлой и набухают в течение пяти минут олигомеризации, частично разрываются через 10 минут и широко разрушаются с помощью исчезнувшего цитозоля через 20 минут.

Эксперименты по связыванию липидов in vitro, контролируемые с помощью ЯМР-спектроскопии, выявляют значительные структурные изменения в белке домена исполнителя MLKL при связывании с липидами для смещения ингибирующей области скоб из закрытой N-спиральной в открытую и внутренне неупорядоченную конформацию, а также информацию о остатках на смесях обоих конформеров. Процентное соотношение закрытых и открытых конформеров в данном образце также можно контролировать, что дает подтверждающие доказательства взаимодействия домена палатера MLKL с фосфолипидами и предполагает прямую связь между MLKL и плазматической мембраной. Таким образом, пытаясь количественно оценить гибель клеток с помощью этой процедуры, важно знать и помнить, что ДНК-связывающий краситель имеет более высокую пороговую флуоресценцию, чем обычно генетически кодирующий флуоресцентный белок.

По этой причине их можно использовать параллельно. Также обратите внимание, что мицеллярные липиды чувствительны к температуре, и поэтому может потребоваться оптимизация температуры образца ЯМР. Таким образом, после этой процедуры можно использовать другие методы, такие как микроскопия полного внутреннего отражения и электромикроскопия, чтобы определить, насколько быстро происходит разрыв клеток на клетках, подвергающихся некроптозу, и где разрыв локализован на плазматической мембране.

Кроме того, может быть выполнен микромасштабный термофорез для ортогональной валидации связывания MLKL с мицеллярными липидами. Методы, описанные в этом видео, проложили путь исследователям в области некроптоза к изучению роли MLKL как исполнителя разрыва плазматической мембраны. Не забывайте, что работа с хлороформом может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток и работа в хорошо проветриваемом помещении.