Чувствительным измерение Mitophagy, поток цитометрии с помощью РН зависимых флуоресцентные репортер mt-Keima

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить чувствительную технику для измерения активности клеточной митофагии с помощью проточной цитометрии. В данной работе мы демонстрируем, что этот метод был успешно использован для оценки резкого увеличения митофагии клеток HeLa после лечения CCCP, митохондриальным разжигателем. Эта методика позволяет очень быстро и легко измерить активность митофагов.

Главное преимущество этой методики заключается в том, что можно чутко измерить активность митофагов в живых клетках без какого-либо дополнительного окрашивания. Таким образом, данная методика в конечном итоге сможет помочь в понимании механизма и физиологической роли митофага. Демонстрировать процедуру будут Джи-Хён Ум и Ён Ён Ким из моей лаборатории.

Начните эту процедуру с подготовки mt-Keima, митохондриального лентивируса Keima. Сначала семена HEK293T клетки в чашке для культур, покрытой поли-L-лизином, и культивируют их при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для тканевых культур в течение одного дня. На следующий день трансфектируют HEK293T клетки лентивирусной ДНК mt-Keima и упаковывают ДНКазу с помощью реагента для трансфекции в соответствии с инструкцией производителя.

После восьми часов трансфекции удалите трансфекционную среду и добавьте восемь миллилитров свежей среды. Соберите среду, содержащую вирусные частицы, через 48 часов и удалите клеточный мусор путем центрифугирования. Далее отфильтруйте вирусосодержащие среды с помощью шприцевого фильтра 0,45 мкм.

Поместите клетки HeLa-Parkin в 60-миллиметровую культуральную чашку за день до сбора лентивируса mt-Keima и культивируйте клетки четырьмя миллилитрами питательной среды в течение одного дня при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе. На следующий день удалите питательную среду, добавьте один миллиметр вирусной среды mt-Keima, добавьте еще два миллилитра питательной среды, содержащей 3 микролитра полибренового стокового раствора, и инкубируйте клетки в течение одного дня в CO2-инкубаторе. Через 24 часа после заражения удалите вирусную среду, дважды промойте клетки PBS и добавьте четыре миллилитра питательной среды.

Для удаления неинфицированных клеток обрабатывайте клетки в течение двух дней двумя микрограммами на микролитр пуромицина. Приготовьте свежую среду, содержащую 10 микромолярных CCCP. Удалите культивированную среду и добавьте четыре миллилитра свежей питательной среды, содержащей CCCP.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в CO2-инкубаторе в течение шести часов. Удалите питательную среду и промойте клетки один раз PBS. Отделите клетки путем обработки раствором трипсина ЭДТА.

Соберите клетки центрифугированием и повторно суспендируйте их в одном миллилитре PBS. Перенесите клетки в трубку FACS и поместите их на лед. Для проточной цитометрии включите проточный цитометр и запустите программное обеспечение для анализа.

Создайте новый эксперимент и выберите BV605 для фиолетового лазера и PE-CF594 для желто-зеленого лазера в окне параметров. Сначала запустите контрольный образец клеток, не инфицированных лентивирусом mt-Keima. На графике прямого разброса против бокового разброса нарисуйте ворота, используя значок многоугольника, вокруг живых клеток и удалите мертвые клетки и остатки клеток.

Затем запускают клетки HeLa-Parkin, зараженные лентивирусом mt-Keima. На точечной диаграмме зависимости BV605 от бокового рассеяния отрегулируйте напряжение таким образом, чтобы клетки HeLa-Parkin, экспрессирующие mt-Keima, были четко отделены от контрольных клеток, которые не экспрессируют mt-Keima. Далее на точечной диаграмме зависимости PE-CF594 от бокового рассеяния отрегулируйте напряжение таким образом, чтобы ячейки HeLa-Parkin, экспрессирующие mt-Keima, были четко отделены от контрольных клеток.

Затем на точечной диаграмме BV605 и PE-CF594 выберите популяцию mt-Keima-положительных клеток, нарисовав вентиль с помощью значка многоугольника. Затем создадим еще одну точечную диаграмму BV605 в сравнении с PE-CF594, показывающую только затворные ячейки mt-Keima. На этой точечной диаграмме нарисуйте ворота вокруг необработанных mt-Keima-положительных клеток.

Эти ворота называются низкими воротами. Затем нарисуйте еще один ворота, содержащий область над низкими воротами. Эти ворота называются высокими воротами, потому что они содержат клетки с высокой активностью митофагии.

Затем выберите меню «Показать иерархию населения». Процент родительского значения представляет собой процент клеток в верхнем затворе среди популяции mt-Keima-положительной. Теперь запустите каждый образец и запишите не менее 10 000 событий в ворота остановки mt-Keima.

Анализ проточной цитометрии необработанных клеток HeLa, экспрессирующих mt-Keima, показал низкий уровень митофагии. Лечение CCCP индуцировало резкое увеличение клеток митофагии в высоких воротах. Процент клеток митофагии увеличился более чем в 10 раз через шесть часов после лечения CCCP.

Это увеличение митофагии при лечении CCCP было полностью устранено совместным лечением бафиломицином А. Как только клетки, экспрессирующие mito-Keima, будут готовы, измерение митофагов с помощью проточной цитометрии может быть проведено в течение одного часа, если оно правильно подготовлено. Для точного анализа митофагов с помощью проточной цитометрии важно правильно настроить верхние и нижние ворота. При анализе новых типов клеток необходимо использовать в качестве контроля хорошо известные клетки, такие как клетки HeLa.

Кроме того, важно помнить, что митофаг должен быть полностью подтвержден дополнительными характеристиками, такими как снижение митохондриального белка и уменьшение митохондриальной ДНК. Этот метод может быть применен к широкому спектру типов клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать митофаг с помощью проточной цитометрии.