На основе плиты крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans: Пробоподготовка для изучения метаболические изменения при сахарном диабете
24 августа 2018 г.
Этот протокол описывает метод для крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans на твердых носителях. Как альтернатива культур в жидкой среде этот протокол позволяет получать параметры различных масштабах культивирования на основе плиты. Это увеличивает сопоставимости результатов, опустив морфологических и метаболические различия между жидких и твердых носителей культуры.
В области C.elegans этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, которые требуют получения больших популяций нематод и образцов с использованием планшетной культуры. Основными преимуществами этого протокола являются его простота в установлении, а также легкость описания, включая подводные камни и приложения. После получения синхронизированной популяции нематод добавьте примерно один миллилитр буфера M nine в пластины, и тщательно распределите буфер, раскачивая пластины.
После этого соберите нематод в 15 миллилитровую пробирку. Теперь переверните трубку и с помощью микроскопа оцените плотность нематод. При необходимости отрегулируйте плотность суспензии и продолжайте оценивать ее под микроскопом.
Нанесите 150 микролитров суспензии непосредственно на пластины с модифицированными наконечниками пипеток. Чтобы обеспечить равномерное распределение нематод между пластинами, переворачивайте трубку с суспензией через равные промежутки времени. Во-первых, промойте нематод с помощью модифицированного наконечника пипетки с примерно 500 микролитрами буфера M nine.
Используя тот же буфер, продолжайте отделять нематод до тех пор, пока большая часть животных не будет собрана во взвешенном состоянии. Далее возьмите нематод с модифицированным кончиком пипетки и переложите их в тарелку с OP50. Модифицированные наконечники пипеток уменьшают напряжение сдвига и повреждение нематод благодаря большему диаметру.
Затем дайте тарелке высохнуть. Перед сбором проб приготовьте жидкий азот для мгновенной заморозки собранных нематод. Затем поместите буфер M nine на лед.
Нанесите по одному миллилитру буфера M nine на каждую пластину и аккуратно взболтайте, чтобы вымыть каждую пластину. Затем возьмите объем М девяти буфера, и переложите его в новые 15 миллилитровые пробирки. Кратковременно центрифугируйте пробирку при 800 умноженных на g, прежде чем удалить большую часть буфера M nine.
Затем промойте образцы три раза 10 миллилитров буфера M nine, чтобы удалить любые бактерии. С помощью стеклянной пипетки переложите каждую гранулу в пустую пробирку объемом 1,5 миллилитра. Используйте стеклянную пипетку, чтобы взять один миллилитр буфера M nine из второй 1,5-миллилитровой пробирки, чтобы смыть нематоды со стенки пипетки.
Затем промойте оставшиеся нематоды из пробирок объемом 15 миллилитров, и перенесите их в пробирки с образцами. Затем центрифугируйте пробирки с образцами при давлении 19 000 раз g в течение одной минуты и удалите как можно больше надосадочной жидкости. Затем запечатайте каждую трубку парафиновой пленкой и сразу же заморозьте их в жидком азоте.
Храните пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия до получения лизата. Добавьте к каждому замороженному образцу те же объемы 0,5-миллиметровых гранул оксида циркония и в два раза больший объем буфера лизата с коктейлем ингибиторов протеиназы. Затем поместите пробирки в гомогенизатор на одну минуту на девятой скорости.
Центрифугируйте образцы в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия и 19 000 раз больше избытка. Наконец, перенесите надосадочную жидкость в новую пробирку на льду и храните ее при температуре минус 80 градусов Цельсия для будущих экспериментов. В этом протоколе большое количество C.elegans было культивировано для применения в исследованиях диабета.
Количество собранных нематод коррелировало с выходом белка лизата, что свидетельствует о том, что воспроизводимое количественное выделение белка может быть достигнуто с помощью этого протокола. Здесь представлен масс-спектрометрический анализ реакционноспособного метаболита метилглиоксаля и конечных продуктов гликирования, образованных воздействием метилглиоксаля. Сравнивали нематод, получавших глюкозу, и контрольную группу.
Перенос нематод через пипетку может создать напряжение сдвига, потенциально причиняя вред нематодам. Уровни окислительного стресса у пипетированных нематод и нематод, перенесенных с помощью металлической проволоки, не различались при использовании этого протокола. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как вестерн-блоттинг, чтобы ответить на дополнительные вопросы по протеомике.
Этот протокол также облегчает проведение экспериментов, которые связывают несколько параметров с одной и той же популяцией.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается метод крупномасштабного культивирования Caenorhabditis elegans на твердых средах. Этот подход позволяет получать большие популяции и образцы нематод, что повышает сопоставимость результатов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Микробиология
Обзор
- Caenorhabditis elegans является широко используемым модельным организмом.
- Культивирование на чашках имеет преимущества перед жидкими культурами.
- Понимание динамики популяции нематод имеет решающее значение для различных направлений исследований.
- Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области изучения C.elegans.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол культивирования C.elegans на твердых средах.
- Обеспечить получение синхронизированных популяций нематод.
- Создать условия для проведения экспериментов, требующих большого объема выборок.
Используемые методы
- Синхронизация популяций нематод.
- Нанесение буфера M9 на чашки.
- Микроскопическая оценка плотности нематод.
- Корректировка плотности суспензии по мере необходимости.
Основные результаты
- Успешное создание крупномасштабных культур нематод.
- Повышение сопоставимости результатов при культивировании на чашках.
- Выявление потенциальных проблем при выполнении протокола.
- Применение в различных исследовательских контекстах.
Выводы
- Данный протокол представляет собой надежный метод культивирования C.elegans.
- Он расширяет возможности проведения крупномасштабных экспериментов.
- Метод является простым и воспроизводимым.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Масштабное культивирование C. elegans позволяет проводить воспроизводимую количественную изоляцию белков для поиска биомаркеров, связанных с диабетом, что способствует валидации мишеней при нейродегенеративных осложнениях. Данный метод обеспечивает масштабируемый рабочий процесс с минимизацией напряжения сдвига для протеомного анализа AGEs и ROS, который может быть напрямую применен для снижения рисков при изучении механизмов на ранних этапах разработки лекарственных препаратов. Обеспечивая подготовку синхронизированной популяции в контролируемых условиях, этот подход повышает прогностическую достоверность доклинических моделей диабетической патологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывающие воздействие глюкозы с образованием конечных продуктов гликирования (AGE) и активных форм кислорода (ROS) в нейрональных моделях.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию мишеней за счет воспроизводимой корреляции выхода белка с количеством нематод.
- Прогностическая ценность: Облегчает отбор приоритетных направлений в портфеле исследований, предоставляя количественные протеомные данные для идентификации ведущих соединений в путях развития осложнений сахарного диабета.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность к анализу: Подготовка валидированных биологических систем для последующего применения в методах вестерн-блоттинга и масс-спектрометрии.
- Воспроизводимость: Стандартизация подготовки образцов для минимизации физиологического воздействия и обеспечения стабильных протеомных результатов.
- Масштабируемость: Возможность интеграции нескольких анализов при идентичных условиях культивирования для совместимости с высокопроизводительным скринингом.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: способствует изучению осложнений диабета с помощью моделей C. elegans, демонстрирующих накопление AGE и ROS независимо от сосудистых факторов.
- Трансляционная преемственность: связывает этап открытия с доклинической валидацией, обеспечивая единообразную подготовку образцов в различных экспериментальных условиях.
- Оптимизация рисков при разработке: позволяет получать надежные лизаты для анализа биомаркеров, снижая количество ложноположительных результатов при определении приоритетных мишеней.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод занимает место в континууме открытий — от проверки гипотез через поиск перспективных соединений-лидеров до доклинической валидации, — в частности, поддерживая исследования нейродегенерации, связанной с диабетом.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о метаболических изменениях при диабете посредством количественного анализа белков и метаболитов.
- Скрининг: Позволяет получать готовые к анализу образцы со стандартизированной плотностью и минимальным напряжением сдвига для надежной оценки соединений.
- Аналитика: Обеспечивает масс-спектрометрическое измерение метилглиоксаля и AGEs, предоставляя количественные данные для сравнения состояний.
- Трансляционные исследования: Связывает открытие нейронального фенотипа с доклиническим этапом за счет использования согласованных протеомных рабочих процессов.
- Корпоративное использование: Создает многократно используемую платформу для крупномасштабного культивирования нематод в рамках множества исследований, связанных с диабетом.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность при валидации мишеней за счет уменьшения механистической неопределенности в моделях осложнений сахарного диабета.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость протеомных рабочих процессов, сводя к минимуму вариабельность при подготовке лизатов.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) благодаря надежным данным о биомаркерах, что снижает биологические риски на поздних этапах программ по изучению диабета.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом рисков на основе воспроизводимых данных о модуляции AGE и ROS.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с C. elegans и методы их синхронизации.
- Необходим доступ к центрифугам, гомогенизаторам и жидкому азоту для обработки образцов.
- Требуется межгрупповая стандартизация протоколов промывки и оценки плотности суспензии.
- Необходимо учитывать особенности адаптации при переносе между планшетами с различными экспериментальными условиями.
- Существуют практические ограничения, связанные с минимизацией напряжения сдвига во время дозирования пипеткой, что решается использованием модифицированных наконечников.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:27
Large Scale Culture on Plates
1:15
Transfer of Large Amounts of Caenorhabditis elegans
1:52
Harvest of a Large Caenorhabditis elegans Sample
3:20
Protein Isolation for Mass Spectrometry
3:56
Results: Reproducible Quantitative Protein Isolation and Further Applications of Large-scale C. elegans Culture
4:47
Conclusion
