Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани

Подход, о котором мы сегодня поговорим, был выведен для сравнения свойств и функциональной активности Т-клеток тканевой и периферической крови. Значимость этой темы иллюстрируется тем фактом, что Т-клетки периферической крови составляют всего 20% от общего числа Т-клеток в организме. Возможность изучать небольшое количество Т-клеток, полученных из тканей, очень важна, и это именно то, чего мы достигли.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что она требует меньшего количества клеток и меньших объемов реагентов, чем традиционные методики. Начните с использования полипропиленовых щипцов ножничного типа, чтобы погрузить стеклянные покровные стекла в свежеприготовленный кислотный раствор пираньи на 25-30 минут. В конце стирки прополощите покровные стекла семь раз в свежем объеме сверхчистой воды для каждой стирки.

Затем отложите влажные покровные стекла в сторону, чтобы остатки воды скатились с чистого стекла. Когда покровные стекла высохнут, нанесите два микролитра окончательной липосомной смеси точно в центр самоклеящегося канала предметного стекла внутри стерильного вытяжного колпака. И немедленно, но осторожно совместите один чистый и сухой покровный лист с предметным стеклом, чтобы его можно было аккуратно опустить на липкую сторону предметного стекла.

И с помощью наружного кольца полипропиленовых щипцов ножничного типа слегка надавите на периферический контакт покровного стекла с предметным стеклом, убедившись, что покровное стекло плотно прикреплено к предметному стеклу для предотвращения утечки. Затем переверните предметное стекло и с помощью перманентного маркера нарисуйте четыре точки вокруг бислоя на внешней стороне узла предметного стекла. Перед первой инъекцией назначьте один порт канала в качестве входного порта, а другой — в качестве выходного, сохраняя это назначение на протяжении всего эксперимента.

Во избежание образования пузырьков вставьте конец наконечника пипетки непосредственно во входное отверстие до тех пор, пока не почувствуете, как резиновое уплотнение канала ползуна проникает наконечником. Медленно заполните канал 50 микролитрами теплого буфера для анализа. Введите 200 микролитров хлорида никеля в раствор, блокирующий казеин, во входное отверстие.

И извлеките 50 микролитров буфера из выходного порта. После 45-минутной инкубации удалите излишки раствора казеина из выходного отверстия. Введите 100 микролитров ICAM-1 в растворе стрептавидина во входной порт для 45-минутной инкубации при комнатной температуре.

По окончании инкубации удалите излишки белкового раствора из выходного отверстия. И промойте бислой два раза 100 микролитрами буфера для анализа на одну промывку. Затем пометьте бислои 100 микролитрами фтор-4-конъюгированных анти-CD3 антител в течение 45 минут при комнатной температуре.

Затем следуют две промывки в 100 микролитрах буфера для анализа на промывку, как показано на рисунке. Чтобы визуализировать взаимодействия бислоев Т-клеток, поместите предметное стекло на нагреваемый при температуре 37 градусов Цельсия предметный столик флуоресценции полного внутреннего отражения, или микроскоп TIRF. И отрегулируйте столик с помощью чернильных меток, чтобы центрировать бислой на объективе 100 степеней.

Для визуализации высвобождения гранул добавьте флуоресцентно-конъюгированные фрагменты анти-CD107A антител FAB в суспензию CD4 Т-клеток. И ресуспендировать меченые клетки в 50 микролитрах буфера для анализа для введения во входной порт слайдового канала. Затем выберите подходящее количество экспериментальных полей и записывайте изображения каждого поля один раз в минуту в течение 30 минут после инъекции.

В этом репрезентативном эксперименте не наблюдалось различий между CD8 Т-клетками, которые образовывали классические иммунологические синапсы на липидных бислоях, встроенных либо в проточную ячейку, либо в многоканальную проточную ячейку. При взаимодействии липидного бислоя CD4 Т-клетки образуют зрелые иммунные синапсы, но либо высвобождают или не высвобождают гранулы, высвобождают гранулы без образования зрелых синапсов, либо не образуют синапсы и не высвобождают гранулы. Следует отметить, что CD4 Т-клетки, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови, способны выделять гранулы почти в два раза быстрее, чем CD4-клетки, полученные из лимфатических узлов.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно поддерживать постоянную температуру и медленно пипетировать, чтобы не образовались пузырьки. В дополнение к нашим возможностям по исследованию интерфейса бислоя Т-клеток, этот подход также позволит нам выполнить межклеточное окрашивание Т-клеток, которые соприкасались с бислоем. Это значительно облегчило бы объем информации, которая может быть использована для описания конкретных Т-клеток, полученных из лимфоидной ткани или других тканей.

Не забывайте, что работа с раствором пираньи чрезвычайно опасна, и очень важно, чтобы вы надевали надлежащие СИЗ во время этой процедуры.