Оценка синаптических интерфейса первичного человека Т-клеток в периферической крови и лимфоидной ткани
July 30th, 2018
Протокол описывает метод для изучения первичного поликлональных человеческих клеток T способность образовывать синаптических интерфейсов с использованием Вселенский липидных бислоев. Мы используем этот метод, чтобы показать возможности формирования дифференциального синапса человека первичной Т-клеток, полученных из лимфатических узлов и периферической крови.
Подход, о котором мы сегодня поговорим, был выведен для сравнения свойств и функциональной активности Т-клеток тканевой и периферической крови. Значимость этой темы иллюстрируется тем фактом, что Т-клетки периферической крови составляют всего 20% от общего числа Т-клеток в организме. Возможность изучать небольшое количество Т-клеток, полученных из тканей, очень важна, и это именно то, чего мы достигли.
Основное преимущество этой методики заключается в том, что она требует меньшего количества клеток и меньших объемов реагентов, чем традиционные методики. Начните с использования полипропиленовых щипцов ножничного типа, чтобы погрузить стеклянные покровные стекла в свежеприготовленный кислотный раствор пираньи на 25-30 минут. В конце стирки прополощите покровные стекла семь раз в свежем объеме сверхчистой воды для каждой стирки.
Затем отложите влажные покровные стекла в сторону, чтобы остатки воды скатились с чистого стекла. Когда покровные стекла высохнут, нанесите два микролитра окончательной липосомной смеси точно в центр самоклеящегося канала предметного стекла внутри стерильного вытяжного колпака. И немедленно, но осторожно совместите один чистый и сухой покровный лист с предметным стеклом, чтобы его можно было аккуратно опустить на липкую сторону предметного стекла.
И с помощью наружного кольца полипропиленовых щипцов ножничного типа слегка надавите на периферический контакт покровного стекла с предметным стеклом, убедившись, что покровное стекло плотно прикреплено к предметному стеклу для предотвращения утечки. Затем переверните предметное стекло и с помощью перманентного маркера нарисуйте четыре точки вокруг бислоя на внешней стороне узла предметного стекла. Перед первой инъекцией назначьте один порт канала в качестве входного порта, а другой — в качестве выходного, сохраняя это назначение на протяжении всего эксперимента.
Во избежание образования пузырьков вставьте конец наконечника пипетки непосредственно во входное отверстие до тех пор, пока не почувствуете, как резиновое уплотнение канала ползуна проникает наконечником. Медленно заполните канал 50 микролитрами теплого буфера для анализа. Введите 200 микролитров хлорида никеля в раствор, блокирующий казеин, во входное отверстие.
И извлеките 50 микролитров буфера из выходного порта. После 45-минутной инкубации удалите излишки раствора казеина из выходного отверстия. Введите 100 микролитров ICAM-1 в растворе стрептавидина во входной порт для 45-минутной инкубации при комнатной температуре.
По окончании инкубации удалите излишки белкового раствора из выходного отверстия. И промойте бислой два раза 100 микролитрами буфера для анализа на одну промывку. Затем пометьте бислои 100 микролитрами фтор-4-конъюгированных анти-CD3 антител в течение 45 минут при комнатной температуре.
Затем следуют две промывки в 100 микролитрах буфера для анализа на промывку, как показано на рисунке. Чтобы визуализировать взаимодействия бислоев Т-клеток, поместите предметное стекло на нагреваемый при температуре 37 градусов Цельсия предметный столик флуоресценции полного внутреннего отражения, или микроскоп TIRF. И отрегулируйте столик с помощью чернильных меток, чтобы центрировать бислой на объективе 100 степеней.
Для визуализации высвобождения гранул добавьте флуоресцентно-конъюгированные фрагменты анти-CD107A антител FAB в суспензию CD4 Т-клеток. И ресуспендировать меченые клетки в 50 микролитрах буфера для анализа для введения во входной порт слайдового канала. Затем выберите подходящее количество экспериментальных полей и записывайте изображения каждого поля один раз в минуту в течение 30 минут после инъекции.
В этом репрезентативном эксперименте не наблюдалось различий между CD8 Т-клетками, которые образовывали классические иммунологические синапсы на липидных бислоях, встроенных либо в проточную ячейку, либо в многоканальную проточную ячейку. При взаимодействии липидного бислоя CD4 Т-клетки образуют зрелые иммунные синапсы, но либо высвобождают или не высвобождают гранулы, высвобождают гранулы без образования зрелых синапсов, либо не образуют синапсы и не высвобождают гранулы. Следует отметить, что CD4 Т-клетки, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови, способны выделять гранулы почти в два раза быстрее, чем CD4-клетки, полученные из лимфатических узлов.
Пытаясь выполнить эту процедуру, важно поддерживать постоянную температуру и медленно пипетировать, чтобы не образовались пузырьки. В дополнение к нашим возможностям по исследованию интерфейса бислоя Т-клеток, этот подход также позволит нам выполнить межклеточное окрашивание Т-клеток, которые соприкасались с бислоем. Это значительно облегчило бы объем информации, которая может быть использована для описания конкретных Т-клеток, полученных из лимфоидной ткани или других тканей.
Не забывайте, что работа с раствором пираньи чрезвычайно опасна, и очень важно, чтобы вы надевали надлежащие СИЗ во время этой процедуры.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Этот протокол описывает метод исследования способностей к формированию синаптического интерфейса первичных поликлональных человеческих Т-клеток с использованием планарных липидных двуслоев. Исследование подчеркивает различия в формировании синапсов между Т-клетками, полученными из лимфатических узлов, и Т-клетками из периферической крови.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Иммунология
- Клеточная биология
Бэкграунд
- Т-клетки периферической крови составляют только 20% от общего числа Т-клеток в организме.
- Изучение Т-клеток, полученных из тканей, важно для понимания иммунных реакций.
- Методика позволяет проводить анализ с меньшим количеством клеток и реагентов по сравнению с традиционными методами.
- Планарные липидные двуслои предоставляют модель для изучения взаимодействий клеток.
Цель исследования
- Сравнить способности к формированию синапсов тканевых и периферических Т-клеток.
- Разработать метод, требующий меньшего количества клеток для анализа.
- Улучшить понимание функциональности Т-клеток в различных средах.
Используемые методы
- Приготовление стеклянных покрытых предметов с использованием кислой пиранской смеси.
- Промывка предметов в ультрачистой воде.
- Использование планарных липидных двуслоев для исследования взаимодействий Т-клеток.
- Оценка формирования синаптического интерфейса между Т-клетками и липидными двуслоями.
Основные результаты
- Демонстрируются различия в способностях к формированию синапсов у Т-клеток из разных источников.
- Подтверждена эффективность метода в изучении небольших популяций клеток.
- Получены представления о функциональных активностях Т-клеток в различных тканях.
- Показаны преимущества использования меньшего количества реагентов в экспериментальных настройках.
Выводы
- Протокол успешно позволяет исследовать формирование синапсов Т-клеток.
- Он представляет ценный инструмент для исследователей, изучающих функциональность Т-клеток.
- Результаты могут иметь значение для понимания иммунных реакций в здоровье и заболеваниях.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Direct assessment of synaptic interfaces in primary human T cells from both peripheral blood and lymphoid tissue addresses a critical gap in translational immunology and cell therapy R&D. This technique enables mechanistic de-risking and predictive confidence by allowing functional interrogation of rare tissue-derived T cell populations using minimal sample input. The approach supports portfolio decisions by providing quantitative, reproducible data on T cell activation and granule release kinetics relevant to immune modulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct functional comparison of tissue- and blood-derived T cells for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by revealing differences in synapse formation and granule release kinetics.
- Facilitates hypothesis testing on immune cell activation pathways using primary human samples.
- Provides quantitative outputs for portfolio triage and early-stage decision making.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, low-input assay platform for evaluating T cell activation and effector function.
- Supports assay standardization and scalability by minimizing cell and reagent requirements.
- Enables screening of functional responses in rare or limited primary cell populations.
- Delivers quantitative, time-resolved readouts suitable for compound or biologic evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant tissue T cell phenotypes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement by comparing functional outputs across health and disease contexts.
- Supports biomarker discovery by correlating synaptic interface dynamics with functional granule release.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and translational research by enabling direct, quantitative analysis of primary T cell function from both blood and tissue sources.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of T cell activation and synapse formation mechanisms.
- Screening: Provides a standardized, scalable assay for functional screening of T cell responses.
- Analytics: Delivers quantitative, time-resolved measurements of granule release and synaptic interface formation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant tissue phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse immune cell functional studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in T cell functional studies.
- Operational Value: Minimizes sample and reagent requirements, enabling studies with rare or limited primary cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust, quantitative data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immune modulation programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and advanced fluorescence microscopy.
- Demands access to TIRF microscopy and precise fluid handling instrumentation.
- Standardization of assay conditions is critical for reproducibility across teams.
- Adaptation may be needed for different tissue sources or T cell subsets.
- Careful handling of hazardous reagents and strict adherence to safety protocols are essential.
