Assays клеток опухоли стволовых клеток глиобластомы мозга исследования миграции и вторжения

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области глиобластомы, опухоли головного мозга, стволовых клеток или биологии BTSC, способствуя выявлению новых подходов к ингибированию миграции и инвазии. Основное преимущество этих методов заключается в том, что они позволяют количественно оценить миграцию и инвазию BTSC с течением времени при различных условиях. Применение этого метода распространяется и на терапию глиобластомы, поскольку миграция и вторжение раковых клеток в нормальную ткань мозга способствует рецидиву заболевания.

Хотя этот метод может дать представление о том, как BTSC мигрируют и инвазируются, он также может быть применен к раковым стволовым клеткам, полученным из других типов опухолей. Начните с размораживания флакона с криогенно консервированными BTSC в стакане с 70% этанолом, помещенном в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия до тех пор, пока не растает последний лед. Разведите размороженные ячейки и 10 миллилитров среды в 15-миллилитровой конической пробирке для их центрифугирования и ресуспендируйте гранулу BTSC в восьми миллилитрах готовой среды.

Перенесите клетки в колбу для культуры T25 на 10–14 дней культивирования в неадгезивных условиях, ежедневно контролируя колбу, и при необходимости добавляйте в клетки от одного до двух миллилитров свежей полной среды. Когда нейросферы достигнут диаметра примерно 250 микрометров, используйте пипетку, чтобы промыть среду на дне колбы, чтобы отделить любые прилипшие клетки и перенести надосадочную жидкость в коническую пробирку объемом 15 миллилитров для центрифугирования. Чтобы диссоциировать нейросферы BTSC на отдельные клетки, повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре предварительно подогретого раствора для отделения клеток и инкубируйте в течение семи минут при температуре 37 градусов Цельсия, а затем проведите 40 растираний с помощью микропипетки P1000, установленной на 800 микролитров.

Когда клетки полностью диссоциируют, добавьте в пробирку пять миллилитров PBS с добавлением антибиотиков для еще одного центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в одном-четырех миллилитрах готовой среды в зависимости от размера гранулы. Затем высейте два-три раза по 10-5 клеток в восемь миллилитров полной среды на колбу Т25 и перенесите колбы в инкубатор для клеточных культур на одну-две недели культивирования. Чтобы оценить влияние интересующего препарата на миграцию, сначала обработайте клетки соответствующей концентрацией препарата в течение подходящего экспериментального периода.

Для подготовки хемотаксисной пластины покройте три лунки мембранных вкладышей и три донные скважины резервуара в каждом условии из 96-луночной хемотаксис-пластины 75 и 225 микролитров 0,2 миллиграмма на миллилитр коллагена типа I соответственно в течение одного часа при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации отасывайте раствор коллагена из каждой лунки, не царапая коллагеновое покрытие, и дважды промойте лунки стерильным ПБС. После последней промывки извлеките вкладыш из пластины и добавьте 225 микролитров среды без фактора роста с добавлением 10% FBS в каждую нижнюю емкостную лунку хемотаксисной пластины.

Затем аккуратно верните верхнюю вставку в нижний резервуар под углом, чтобы избежать образования пузырьков, и добавьте в каждую лунку 2,5 раза по 10 к третьей диссоциированные БТСК в 50 микролитры среды без фактора роста. Важно полностью диссоциировать BTSC на отдельные клетки и тщательно подсчитать их перед нанесением покрытия, чтобы избежать скопления клеток или слишком большого количества клеток в верхней вставке. Чтобы изобразить миграцию BTSC вдоль градиента FBS, поместите пластину в систему визуализации живых клеток и настройте программное обеспечение автоматизированной визуализации на получение микроскопических изображений пластины каждые один-два часа в течение 72 часов.

Когда получение изображения будет завершено, выберите новое определение обработки, чтобы отличить BTSC от вставленных ими пор на нижней стороне мембраны, изменив анализ, если он не позволяет точно отличить клетки от фоновой мембраны по мере необходимости. Чтобы количественно оценить клетки, которые мигрировали через поры, соберите данные в виде площади поверхности клетки на нижней стороне мембраны для каждой из трех реплицируемых лунок в каждом состоянии, а затем изобразите график миграции клеток в виде площади мигрировавших клеток в микрометрах в квадрате с течением времени. Чтобы оценить инвазию нейросферы BTSC, сначала добавьте интересующее соединение в колбу в желаемой концентрации в течение заранее определенного периода времени до инвазионирования нейросферы.

Когда средний размер нейросферы достигнет примерно от 150 до 200 микрометров, опрокиньте и осторожно перемешайте колбу с пипеткой и перенесите 500 микролитров ресуспендированных нейросфер BTSC в одну 1,5-миллилитровую пробирку на каждый экспериментальный условия на льду. Аспирируйте как можно больше среды со дна каждой 1,5-миллилитровой пробирки, не теряя гранулу нейросферы, и мягко суспендируйте нейросферы в 500 микролитрах свежеприготовленного раствора коллагена типа I типа 0,4 миллиграмма на миллилитр. Перенесите 100 микролитров нейросфер, взвешенных в коллагене, в три лунки на каждую лунку на новую 96-луночную пластину на льду и дайте нейросферам отстояться в течение пяти минут.

Очень важно дать нейросферам отстояться на льду в течение пяти минут. В противном случае сферы не будут находиться в одной плоскости фокуса для визуализации. После пяти минут полимеризации коллагена в инкубаторе для клеточных культур перенесите планшет в лоток системы визуализации живых клеток, чтобы получить эталонное изображение размера нейросферы на момент нанесения покрытия до начала инвазии.

Затем настройте программное обеспечение на получение изображений каждые один-два часа, пока скорость вторжения не выйдет на плато, обычно на 24 часа. Чтобы получить изображение увеличивающейся площади поверхности BTSC по мере их проникновения в матрицу с течением времени, используйте объектив 10X для получения четырех изображений на лунку для каждого набора из трех реплицируемых лунок. Чтобы определить относительную площадь поверхности ячейки, представленную в виде процента слияния лунки, настройте определение обработки, которое специально выделяет ячейки на фоне лунки, затем соберите данные как общую площадь поверхности ячейки для каждой скважины в каждой временной точке, определите среднее значение трех повторяющихся лунок. и построить график инвазии BTSC, построив график увеличения площади ячеек с течением времени.

BTSC, покрытые как одиночные клетки, могут быть выращены в виде свободно плавающих нейросфер. Затем нейросферы могут быть обработаны представляющим интерес препаратом и обработаны для хемотаксис-анализа влияния терапевтических вмешательств на миграцию BTSC. Если BTSC не полностью диссоциированы, клетки не мигрируют через поры и остаются в виде небольших нейросфер.

Если на лунку наносится более чем в 2,5 раза по 10-треть BTSC, клетки слипаются, а не мигрируют на нижние стороны мембран. Кроме того, важно избегать образования пузырьков в лунках мембранной вставки во время гальванизации ячеек или при помещении мембранной вставки в донный резервуар, так как пузырьки препятствуют точной визуализации и количественной оценке клеток. Вторжение BTSC из нейросфер в окружающую матрицу может быть визуализировано и измерено с течением времени в формате 96-луночных планшетов.

Влияние терапевтических вмешательств на инвазию BTSC можно оценить путем количественной оценки площади поверхности клеток по мере их проникновения в матрикс с течением времени. Встраивание нейросфер BTSC с диаметром более 200 микрометров приводит к плоскости фокуса, которая слишком велика для точного количественного определения всех сфер в поле зрения. Аналогичным образом, неспособность поддерживать матрицу на уровне четырех градусов Цельсия при встраивании нейросфер в коллаген для анализа инвазии также может привести к тому, что сферы не находятся в одной плоскости фокуса с внеклеточным матриксом, который не затвердевает равномерно, что препятствует точному получению данных.

При попытке проведения этой процедуры важно помнить об оптимизации условий лечения препаратами и времени получения изображений для каждой исследуемой культуры BTSC. Эта процедура также может быть изменена, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как раковые стволовые клетки из других типов опухолей мигрируют и проникают in vitro. Этот метод может помочь исследователям в области биологии рака проложить путь к изучению миграции и инвазии in vitro в глиобластоме BTSC.