В Vitro подход к фотодинамической терапии

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о фотодинамической терапии, также известной как ФДТ. Вопросы, на которые можно ответить с помощью этого метода, включают продолжительность инкубации фотосенсибилизатора или использование различных параметров в эксперименте, таких как изменение температуры путем нагрева или охлаждения клеток. Этот метод может помочь облегчить разработку in vitro новых фотосенсибилизаторов, протоколов и показаний к ФДТ.

Начните с двукратного 10-4 погружения клеток в два миллилитра питательной среды в каждую лунку шестилуночного планшета с использованием стерильной техники для 24-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе. На следующий день промойте клетки не менее чем двумя миллилитрами PBS и обработайте культуры нулевыми, нулевыми целыми пятью, одним или двумя миллиметровыми разведениями свежеприготовленной 5-ALA. Затем поместите пластину на нагревательный блок с температурой 36-37 градусов Цельсия на 30 минут в защищенном от света месте.

Во время процедуры мы рекомендуем исследователям на этапе инкубации использовать нагревательный блок для достижения постоянной температуры на протяжении всего инкубационного периода. Кроме того, мы рекомендуем накрывать клетки во время инкубационного периода алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить раннюю активацию фотосенсибилизатора. По окончании инкубации промойте клетки в каждой лунке двумя миллилитрами PBS.

И освежите культуры двумя миллилитрами свежей питательной среды для облучения синим светом. Перед облучением клеток нагрейте устройство синего света на выходной длине волны 417 нм в течение одного цикла 1000 секунд и используйте фотометр для измерения излучения на поверхности клетки, регулируя расстояние света для достижения соответствующей интенсивности излучения в соответствии с интенсивностью источника света. Затем поместите обработанные 5-ALA клетки на черную поверхность под синим светом на 1000 секунд с общей скоростью 10 джоулей на квадратный сантиметр.

Во время фотоактивации мы рекомендуем размещать ячейки на черной поверхности, чтобы предотвратить отражение света и неравномерное дозирование. В конце сеанса фототерапии промойте клетки в каждой лунке двумя миллилитрами PBS и отделите клетки одним миллилитром 0,25% трипсина-ЭДТА на лунку. Через три-пять минут подтвердите отслойку и деактивируйте трипсин с помощью 10% FBS и PBS.

Перенесите клетки из каждой лунки в отдельные проточные трубки объемом пять миллилитров и соберите клетки путем центрифугирования. Добавьте в каждый образец 200 микролитров проточного буфера с конъюгированным антителом аннексина-V. Повторно подвесьте клетки и поместите пробирки в инкубатор на 20 минут, чтобы обеспечить связывание аннексина-V.

В конце инкубации добавьте три микролитра 7-AAD к каждому образцу и снова инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут с последующим анализом образца, выполненным в соответствии со стандартными протоколами проточного цитометрического анализа. После пяти сеансов фототерапии АЛК и синим светом наблюдается дозозависимое увеличение апоптоза клеток. Для расчета процента клеток, подвергающихся апоптозу, прибавляют процент клеток в квадрантах аннексина-V высокого, 7-AAD низкого и аннексина-V высокого, 7-AAD высокого.

Несоответствия в продолжительности инкубационного периода пяти ALA, температуре инкубации или дозе фотоактивационного облучения могут изменить эффективность фототерапии, приводя, например, к температурно-зависимому увеличению апоптоза. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, включая RTQPCR и вестерн-блоттинг, чтобы определить, как ФДТ изменяет экспрессию генов и активность белка. Этот метод позволяет исследователям, заинтересованным в фотодинамической терапии, обнаружить влияние на раковые клетки кожи и другие кожные заболевания in vitro.