Assay цифровой полимеразной цепной реакции для генетической вариации в спорадических семейное аденоматозное Polyposis пациента, используя формат чип в трубе
20 августа 2018 г.
Цифровая полимеразной цепной реакции (ПЦР) является полезным инструментом для обнаружения высок чувствительности единичных нуклеотидных вариантов и ДНК копирования число вариантов. Здесь мы демонстрируем ключевые соображения для измерения редкие варианты в геноме человека, используя цифровые ПЦР с форматом чип в трубе.
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области генетического тестирования, такие как обнаружение мозаицизма и генетическое тестирование на основе жидкой биопсии. Основным преимуществом данной методики является высокая пропускная способность детектирования низковариативной аллельной фракции. Применение этого метода распространяется и на диагностику опухолей, потому что обнаружение онкогенных мутаций с высокой чувствительностью может внести вклад в прецизионную медицину.
Начните этот эксперимент с добавления 10 л буфера для образца ДНК в пробирки полоски из 8 пробирок. Затем добавьте 1 микролитр лестницы ДНК в первую пробирку полоски из 8 пробирок, и по одному микролитру образца геномной ДНК в каждую из оставшихся пробирок. Используйте насадку для микропланшета для смешивания содержимого 8-пробирочной полоски путем вортексирования в течение одной минуты.
Поместите полоску, наконечники пипеток и гелевое устройство в инструмент для электрофореза. Нажмите кнопку старта, чтобы начать забег. После завершения прогона проверьте электроферограмму на дисплее, чтобы убедиться, что нижний маркер, содержащийся в буфере для образца ДНК, правильно назначен на электроферограмме.
Если нет, вручную назначьте маркер в режиме электроферограммы программного обеспечения. Затем в режиме области программного обеспечения укажите область размера геномной ДНК для автоматического расчета концентрации ДНК. Добавьте ранее разработанные праймеры, зонды и геномную ДНК в новую полоску из 8 пробирок, чтобы получить общий объем 15 л. Пипетка вверх и вниз для смешивания.
Добавьте загрузочную платформу на стружку, встроенную в свежую 8-трубную полосу, а затем поместите трубную полосу в автозагрузчик. Убедитесь, что между стружкой и погрузочной платформой есть контакт. Затем поместите загрузочный слайдер на платформу и используйте стопор, чтобы удерживать слайдер от погрузчика.
Пипетируйте 15 л ПЦР-смеси возле кончика ползунка, а затем нажмите кнопку загрузчика, чтобы запустить загрузчик в течение одной минуты. Снимите трубную полосу с погрузчика после пробега и поместите ее в усилитель герметизации. Осторожно надавите на горную крышку и край верхней крышки.
Запустите усилитель герметизации примерно на две минуты. Если герметизация неполная, о чем свидетельствует лужа жидкости, повторите прогон еще минуту. Добавьте в трубки 230 л уплотнительной жидкости.
Поместите полоску пробирки в термоамплификатор и запустите ПЦР, как описано в протоколе. Если наблюдается неравномерное распределение положительных разделов, отрегулируйте температуру или продолжительность ПЦР. Чтобы обнаружить и проанализировать интенсивность флуоресценции продуктов ПЦР, поместите полоску пробирки на приспособление для обнаружения и добавьте 6 мл дистиллированной воды.
Удалите все видимые пузырьки воздуха с помощью наконечника для дозатора. Загрузите приспособление в детектор. В программном обеспечении для обнаружения выберите вкладки «Флуоресценция», «Эксперимент», а затем «Образец NTC» и нажмите кнопку «ВЫПОЛНИТЬ», чтобы начать прогон.
После завершения прогона подтвердите график положения, гистограмму и 2-D диаграмму рассеяния. Чтобы собрать продукт ПЦР, удалите герметизирующую жидкость из пробирки. Добавьте 100 л буфера TE и энергично ворксируйте в течение 30 секунд.
Кратковременно центрифугируйте пробирки в настольной центрифуге и действуйте, как описано в текстовом протоколе, чтобы завершить сбор продукта ПЦР. Позиционные графики, созданные с помощью цифровой ПЦР, показывают желтую флуоресценцию HEX как у пациентов, так и у отца, что указывает на наличие варианта аллеля APC T, но не в контрольной группе. Только геномная ДНК пациентов содержит С-вариант, о чем свидетельствует зеленая флуоресценция FAM.
Как подтверждается с помощью диаграмм рассеяния, и пациент, и отец имеют положительный результат на HEX, или вариант Т, в то время как только у пациента наблюдается наличие варианта С. Фракция варианта аллеля пациента, или VAF, рассчитанная с помощью DPCR, составила 13,2%, аналогично 12,7%, достигнутым с помощью секвенирования следующего поколения. С другой стороны, ВАФ родителей и здоровых доноров пациентов составляли менее 0,1%Электроферез собранных и концентрированных продуктов DPCR подтверждает, что размер предсказанного фрагмента составляет 123 пары оснований в ДНК пациентов и родителей. При выполнении этой процедуры важно помнить о необходимости содержать скамейку в чистоте, например, с помощью фильтра вентилятора.
Обзор
В данной статье рассматривается применение цифровой полимеразной цепной реакции (ПЦР) для чувствительного обнаружения однонуклеотидных вариантов и вариаций числа копий ДНК. В ней освещаются методология и значение использования цифровой ПЦР в генетическом тестировании, в частности, для диагностики опухолей.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Генетика
- Онкология
- Методы диагностики
Введение
- Цифровая ПЦР позволяет осуществлять высокопроизводительный анализ низких фракций вариантных аллелей.
- Данный метод эффективен для выявления мозаицизма и при проведении генетического тестирования на основе жидкостной биопсии.
- Он вносит вклад в развитие персонализированной медицины, обеспечивая высокочувствительное обнаружение онкогенных мутаций.
Цель исследования
- Продемонстрировать эффективность цифровой ПЦР в определении редких генетических вариантов.
- Представить подробный протокол реализации данного метода.
- Изучить возможности применения цифровой ПЦР в клинической диагностике.
Используемые методы
- Подготовка образцов ДНК и их смешивание с праймерами и зондами.
- Электрофорез для первичного анализа ДНК.
- Использование амплификатора для проведения ПЦР.
- Детекция продуктов ПЦР с помощью анализа интенсивности флуоресценции.
Основные результаты
- Успешное обнаружение вариантов аллелей APC в образцах пациентов.
- Доля вариантного аллеля (VAF), рассчитанная с помощью цифровой ПЦР, была сопоставима с результатами секвенирования следующего поколения.
- Электрофорез подтвердил размер продуктов ПЦР.
- Продемонстрирована важность поддержания чистоты рабочего пространства во время процедуры.
Выводы
- Цифровая ПЦР является мощным инструментом для детекции редких генетических вариантов.
- Данный метод имеет важное значение для диагностики рака и персонализированной медицины.
- Правильное выполнение протокола имеет решающее значение для получения точных результатов.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Цифровая ПЦР позволяет проводить точный количественный анализ низких фракций вариантных аллелей, что способствует раннему выявлению соматического мозаицизма в генах предрасположенности к раку. Эта возможность улучшает валидацию мишеней, обеспечивая ортогональное подтверждение редких вариантов, выявленных с помощью секвенирования. Формат «чип в пробирке» повышает пропускную способность для приложений доклинического скрининга, требующих высокой чувствительности.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем выявления низкочастотных вариантов APC при спорадическом семейном аденоматозном полипозе.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет ортогональной валидации мозаицизма, обнаруженного в образцах пациентов.
- Прогностическая ценность: количественное определение фракции аллелей варианта помогает в сортировке портфеля препаратов, подтверждая наличие варианта в системах, релевантных для данного заболевания.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Формат «чип в пробирке» позволяет проводить восемь одновременных реакций dPCR, что улучшает стандартизацию рабочих процессов скрининга мутаций.
- Количественный результат: Точное измерение VAF (13,2% у пациента) позволяет надежно оценивать комбинированный эффект в доклинических моделях.
- Масштабируемость: Процедуры герметизации и сбора поддерживают воспроизводимый анализ партиций для последующего подтверждения.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Выявление соматического мозаицизма APC согласуется с опухолегенными путями в моделях колоректального рака.
- Трансляционная преемственность: Соответствие VAF данным NGS (12,7%) обосновывает решения по дальнейшему продвижению с учетом рисков при доклинической валидации.
- Снижение механистических рисков: Диаграммы рассеяния на основе флуоресценции подтверждают специфичность варианта, что снижает риск ложноположительных результатов при выборе мишени.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум исследований — от валидации мишени до идентификации ведущих соединений, обеспечивая количественный генетический анализ для снижения механистических рисков.
- Открывающая биология: Оказывает поддержку в проверке гипотез путем количественного определения частот аллелей вариантов APC в образцах при семейном раке.
- Скрининг: Формат «чип в пробирке» обеспечивает воспроизводимость анализа и количественные результаты для кампаний по скринингу мутаций.
- Аналитика: Анализ интенсивности флуоресценции и диаграммы рассеяния позволяют получить статистические данные для сравнения условий вариантов в различных образцах.
- Трансляционные исследования: Измерения VAF связывают результаты открытий с доклинической преемственностью в моделях аденоматозного полипоза.
- Корпоративное повторное использование: Стандартизированные процедуры герметизации и сбора позволяют повторно использовать платформу для нескольких генетических мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишени за счет чувствительного обнаружения низких фракций вариантных аллелей.
- Операционная ценность: Стандартизация с помощью формата «чип в пробирке» и протоколов герметизации обеспечивает воспроизводимость между сериями анализов.
- Стратегическая ценность: Снижение биологических рисков на поздних стадиях за счет раннего подтверждения мозаицизма в процессе поиска.
- Влияние на портфель: Приоритизация с учетом рисков благодаря ортогональным измерениям VAF, соответствующим эталонным показателям NGS.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области настройки dPCR, флуоресцентного детектирования и программного обеспечения для анализа разделений.
- Необходимы амплификатор, устройство детектирования и оборудование для усиления герметизации при проведении реакций на чипе.
- Требуется межкомандная стандартизация времени герметизации и размещения крышки предметного стекла для предотвращения неравномерности разделений.
- При адаптации метода следует рассмотреть оптимизацию продолжительности ПЦР для обеспечения равномерного распределения разделений для различных типов образцов.
- Практическое ограничение: требуется тщательное заполнение и герметизация чипа во избежание завышения или занижения количества положительных разделений.
