Автоматизированный метод для определения производительности дрозофила в ответ на изменения температуры в пространстве и времени
12 октября 2018 г.
Здесь мы представляем протокол автоматически определять опорно производительность дрозофилы на изменение температуры, с использованием программируемой температуры Арена, которая производит быстрой и точной температуры изменения во времени и пространстве.
Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы о реакции мух на изменения температуры, такие как различия между генотипами, взаимодействие с другими сенсорными сигналами, или функция различных рецепторов температуры. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет несколько быстрых и точных изменений температуры контроля времени и пространства и в автоматическом режиме. Начните с размещения 20 мужчин и 20 самок мух в бутылке для выращивания, содержащей 45 миллилитров мухи пищевой среды, и размещение бутылки внутри 25 градусов по Цельсию инкубатор под 12 часов света, 12 часов темных циклов.
Через 10 дней, анестезировать вновь исключенных мух на двуокиси углерода колодки в течение максимум четырех минут. И использовать кисть для сбора девственных мух в 2,5 на 9,5 сантиметра летать выращивания флаконов, содержащих 6,5 миллилитров свежей мухи пищевой среды, разделенных сексом на группы по 20 мух на флакон. Затем верните флаконы в инкубатор на пять-семь дней.
Чтобы настроить температурную арену, включите арену и откройте сценарий температурных фаз в компьютере управления. Убедитесь, что последовательность температур правильно установлена, и убедитесь, что продолжительность каждой экспериментальной фазы установлена на 60 секунд. Под стартовым экспериментальным разделом блока, подтвердите эти настройки: желаемое количество фаз, итеративная установка индикативного красного света, излучающего диоды, два градуса по Цельсию повышение температуры на фазу, и 16 градусов по Цельсию в качестве стартовой температуры.
Затем запустите сценарий фазы температуры. Программное обеспечение будет инициализировать в течение пяти секунд, а затем остановить. Для температурных поведенческих экспериментов поместите прядь белой кон проводимой ленты на верхнюю часть медной плитки арены, гарантируя, что все края покрыты.
Поместите нагретое алюминиевое кольцо вокруг медной плитки и используйте чистую ткань, чтобы протереть стеклянную крышку. Поместите крышку на верхней части алюминиевого кольца, оставляя зазор, через который муха может быть взорван и нажмите акклиматизированный флакон летать два раза, чтобы заставить мух на дно флакона. Используя аспиратор рта, поймать одну муху и закрыть флакон, прежде чем положить его обратно в инкубатор.
Удар летать на арену через зазор между стеклянной крышкой и алюминиевым кольцом и сразу же нажмите стеклянный клевер, чтобы закрыть разрыв. Поместите рамку огней вокруг арены, чтобы обеспечить симметричное освещение и начать запись с программой видеозаписи. Затем нажмите на планку пространства компьютера управления, чтобы начать работать экспериментальные фазы.
Чтобы отслеживать видео, откройте программное обеспечение для отслеживания шагов fly и откройте файл конфигурации в папке fly tracker. Установите местоположение видео в папке видео и имена видео в видеофайлых. Укажите границы летной арены в настройках арены на основе координат пикселей x/y нескольких точек на краю арены.
Конкретное расположение неактивных красных светодиодов в светодиодных настройках, на основе координат пикселей x/y расположения центра светодиодов. Чтобы проверить расположение границ лету арене, установить отладку, чтобы верно в настройках арены, нажмите сохранить, и запустить сценарий в терминале. Захват экрана видео появится с синим квадратом, сформированным координатами, вводимыми в настройках арены.
Затем измените отладку в настройках арены на ложную. Нажмите сохранить, и запустить экран в терминале снова, чтобы начать процесс отслеживания. В типичном температуре поведенческого эксперимента, одиночные мухи подверглись действию до 16, 20, или 24 градусов celsius exhibit более высокое движение в начале эксперимента, чем после 5 минут.
Арену, контролируемую температурой, также можно использовать для сравнения поведенческих реакций мух различных генетических фонов с динамическими изменениями температуры. Например, в этом эксперименте скорость всех проверенных видов увеличивалась в соответствии с их собственными кривыми реакции по мере повышения температуры, до достижения точки максимальной производительности, после чего их скорость разлагалась и мухи гибли. Когда отдельные мухи подвергались воздействию 40 градусов по Цельсию в середине и одной боковой плитки, с другой стороны плитки на удобные 22 градусов по Цельсию диких мух типа быстро перестал двигаться вдоль арены и остаются в удобном месте.
В отличие от этого, классический мутант памяти Dunce мухи продолжают исследовать арену и тратить меньше времени, чем элементы управления в удобном месте. Кроме того, тестирование комбинаций температуры и местоположения также полезно для понимания функции различных температурных рецепторов во время динамических изменений температуры. Как показано в этом эксперименте, в котором отдельные мутанты d melanogaster подвергались воздействию повышения температуры в то время как изменение комфортное расположение на 22 градусов по Цельсию также было предоставлено.
Выполняя эти процедуры, не забудьте выполнить шаги в порядке и быстро, так что вы можете захватить как можно больше поведения мух, как это возможно. Рядом с этой процедурой другие методы, такие как отрицательный геотаксис или теплодушие анализы могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как, где мухи двигаться нормально или имеют нормальную теплостойкость. Последствия этого метода распространяются на нас понимание неврологических расстройств или мутаций, в которых восприятие температуры или боль играют определенную роль.
Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что каждый шаг прост сам по себе, но они должны быть прекрасно скоординированы, поэтому техника должна быть отработана.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол оценки локомоторной активности Drosophila в ответ на изменение температуры с использованием программируемой арены с контролируемым температурным режимом. Этот метод обеспечивает быстрые и точные изменения температуры, что облегчает изучение реакций мух на изменения условий окружающей среды.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Поведенческая биология
- Температурная чувствительность
Теоретические сведения
- Drosophila служит модельным организмом для изучения генетических и средовых взаимодействий.
- Изменения температуры могут значительно влиять на локомоторную активность и поведение.
- Понимание этих реакций может дать представление о сенсорной обработке и адаптации.
- Автоматизированные методы повышают точность экспериментальных условий.
Цель исследования
- Изучить локомоторную активность Drosophila при различных температурах.
- Исследовать различия в реакциях разных генотипов.
- Проанализировать взаимодействие с другими сенсорными сигналами.
Используемые методы
- Использование программируемой арены с регулируемой температурой.
- Размещение мух мужского и женского пола в контролируемых условиях.
- Мониторинг локомоторной активности при различных температурных режимах.
- Автоматизированный сбор данных для точного анализа.
Основные результаты
- Продемонстрирована способность быстро изменять температуру и оценивать поведение мух.
- Выявлены значительные различия в локомоторной активности у разных генотипов.
- Показано взаимодействие между температурными ответами и сенсорными стимулами.
Выводы
- Данный метод обеспечивает надежную основу для изучения температурной чувствительности у Drosophila.
- Полученные результаты способствуют пониманию генетических и средовых факторов, влияющих на поведение.
- В будущих исследованиях этот метод может быть использован для более широкого применения в нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет проводить высокопроизводительную автоматизированную оценку температурно-зависимой локомоторной активности Drosophila, предоставляя количественные фенотипические данные для валидации мишеней в нейрогенетических исследованиях. За счет фиксации динамических поведенческих реакций на пространственно и временно контролируемые тепловые стимулы, метод способствует механистическому снижению рисков при изучении путей температурного сенсинга, имеющих значение для моделей боли и сенсорных расстройств. Автоматизированный трекинг и воспроизводимый контроль условий окружающей среды повышают прогностическую достоверность на ранних этапах поиска в исследованиях функций генов и их взаимодействия с окружающей средой.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать генетический вклад в фенотипы термического ответа, что способствует функциональной валидации генов температурного сенсинга и нейронных путей.
- Практическая ценность: облегчает параллельное сравнение мутантных штаммов и штаммов дикого типа в идентичных, программируемых условиях окружающей среды для выявления специфических для генотипа эффектов.
- Прогностическая ценность: позволяет получать кривые эффективности, подобные кривым «доза-ответ», по температурным градиентам, что помогает определить функциональные пороги и градиенты выраженности фенотипа для приоритизации целей.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет получать количественные показатели локомоции (скорость, предпочтение локации), которые служат надежными высококонтентными фенотипическими показателями для скрининга генетических библиотек или фармакологических модуляторов термической чувствительности.
- Операционная ценность: Автоматизированный видеотрекинг и стандартизация арены снижают вариабельность между экспериментами, обеспечивая масштабируемость и воспроизводимость анализов, подходящих для кампаний по скринингу со средней и высокой пропускной способностью.
- Готовность анализа: Позволяет получать нормализованные поведенческие метрики, которые могут быть сопоставлены по различным генотипам и экспериментальным партиям, что способствует валидации анализа и воспроизводимости результатов между разными лабораториями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная значимость: Моделирует механизмы термической адаптации эктотермных организмов, позволяя изучить консервативные пути нейронной термосенсорики, которые могут иметь значение для поиска мишеней в области болевых ощущений и терморегуляции у млекопитающих.
- Доклиническая преемственность: Обеспечивает возможность лонгитюдной оценки кривых термической работоспособности, что способствует принятию обоснованных решений о продвижении по этапам валидации мишеней путем установления взаимосвязей между генотипом, фенотипом и окружающей средой.
- Механистическое снижение рисков: Позволяет детально изучить функцию температурных рецепторов с помощью пространственного и временного термического профилирования, что уменьшает неопределенность при установлении связи между генетическими повреждениями и дефицитом сенсорной обработки.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум ранних этапов поиска, связывая генетическое воздействие с количественным поведенческим результатом в контролируемом контексте среды, что способствует валидации мишеней на основе гипотез и поиску перспективных соединений в нейроповеденческих исследованиях.
- Открытия в биологии: обеспечивает систематическое исследование функций генов, отвечающих за температурное восприятие, путем корреляции генетического фона с динамическими локомоторными реакциями на контролируемые тепловые стимулы.
- Скрининг: предоставляет стандартизированные количественные показатели поведения (например, скорость, пространственные предпочтения), что позволяет проводить надежный скрининг соединений или генотипов в температурно-зависимых путях.
- Аналитика: формирует поведенческие наборы данных с временным и температурным разрешением, подходящие для статистического сравнения кривых эффективности, тепловых порогов по типу EC50 и показателей площади под кривой в различных экспериментальных группах.
- Трансляционные исследования: связывает фенотипы тепловой реакции Drosophila с консервативными механизмами сенсорной трансдукции, что помогает в валидации мишеней для разных видов в исследованиях термосенсорики и боли.
- Корпоративное повторное использование: автоматизированная арена и конвейер трекинга представляют собой многократно используемую платформу для изучения взаимодействий между генами и окружающей средой в различных сенсорных модальностях, помимо термосенсорики.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов работы нейронных цепей терморецепции за счет возможности точного пространственно-временного теплового воздействия и автоматизированного количественного анализа поведения.
- Операционная ценность: гарантирует воспроизводимость результатов благодаря стандартизированному контролю условий окружающей среды, автоматизированному сбору данных и сокращению ручного вмешательства, что минимизирует вариабельность, зависящую от оператора.
- Стратегическая ценность: повышает достоверность принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя объективные количественные фенотипические данные, что снижает зависимость от субъективной оценки поведения при нейрогенетических скринингах.
- Влияние на портфель разработок: позволяет проводить приоритизацию мишеней с учетом стратификации рисков путем установления связи между генетическими повреждениями и измеримым дефицитом тепловой реакции, что способствует раннему выявлению высокоперспективных терапевтических мишеней.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с Drosophila, разработки поведенческих тестов и настройки программного обеспечения для видеотрекинга.
- Результаты зависят от аппаратного обеспечения арены с контролем температуры, синхронизированного освещения и систем видеозаписи для точного сбора данных об окружающей среде и поведении.
- Необходима межкомандная стандартизация калибровки арены, параметров трекинга и определений термического протокола для обеспечения воспроизводимости результатов между различными площадками или пользователями.
- Адаптация метода для других моделей насекомых или сенсорных стимулов может потребовать перекалибровки размеров арены, порогов трекинга и скорости изменения температуры в зависимости от размеров конкретного вида и кинетики его реакций.
- Практические ограничения включают ограниченную пропускную способность арены (одна муха за один запуск) и необходимость тщательной координации процедур для соблюдения временного соответствия между температурными сдвигами и записью поведения.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Fly and Temperature-Controlled Arena Preparation
2:02
Temperature Behavioral Experiments
3:13
Video Tracking and Data Analysis
4:31
Results: Representative Drosophila Performance Analyses in Response to Temperature Changes in Space and Time
6:08
Conclusion
