Автоматизированный метод для определения производительности дрозофила в ответ на изменения температуры в пространстве и времени

Здесь мы представляем протокол автоматически определять опорно производительность дрозофилы на изменение температуры, с использованием программируемой температуры Арена, которая производит быстрой и точной температуры изменения во времени и пространстве.

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы о реакции мух на изменения температуры, такие как различия между генотипами, взаимодействие с другими сенсорными сигналами, или функция различных рецепторов температуры. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет несколько быстрых и точных изменений температуры контроля времени и пространства и в автоматическом режиме. Начните с размещения 20 мужчин и 20 самок мух в бутылке для выращивания, содержащей 45 миллилитров мухи пищевой среды, и размещение бутылки внутри 25 градусов по Цельсию инкубатор под 12 часов света, 12 часов темных циклов.

Через 10 дней, анестезировать вновь исключенных мух на двуокиси углерода колодки в течение максимум четырех минут. И использовать кисть для сбора девственных мух в 2,5 на 9,5 сантиметра летать выращивания флаконов, содержащих 6,5 миллилитров свежей мухи пищевой среды, разделенных сексом на группы по 20 мух на флакон. Затем верните флаконы в инкубатор на пять-семь дней.

Чтобы настроить температурную арену, включите арену и откройте сценарий температурных фаз в компьютере управления. Убедитесь, что последовательность температур правильно установлена, и убедитесь, что продолжительность каждой экспериментальной фазы установлена на 60 секунд. Под стартовым экспериментальным разделом блока, подтвердите эти настройки: желаемое количество фаз, итеративная установка индикативного красного света, излучающего диоды, два градуса по Цельсию повышение температуры на фазу, и 16 градусов по Цельсию в качестве стартовой температуры.

Затем запустите сценарий фазы температуры. Программное обеспечение будет инициализировать в течение пяти секунд, а затем остановить. Для температурных поведенческих экспериментов поместите прядь белой кон проводимой ленты на верхнюю часть медной плитки арены, гарантируя, что все края покрыты.

Поместите нагретое алюминиевое кольцо вокруг медной плитки и используйте чистую ткань, чтобы протереть стеклянную крышку. Поместите крышку на верхней части алюминиевого кольца, оставляя зазор, через который муха может быть взорван и нажмите акклиматизированный флакон летать два раза, чтобы заставить мух на дно флакона. Используя аспиратор рта, поймать одну муху и закрыть флакон, прежде чем положить его обратно в инкубатор.

Удар летать на арену через зазор между стеклянной крышкой и алюминиевым кольцом и сразу же нажмите стеклянный клевер, чтобы закрыть разрыв. Поместите рамку огней вокруг арены, чтобы обеспечить симметричное освещение и начать запись с программой видеозаписи. Затем нажмите на планку пространства компьютера управления, чтобы начать работать экспериментальные фазы.

Чтобы отслеживать видео, откройте программное обеспечение для отслеживания шагов fly и откройте файл конфигурации в папке fly tracker. Установите местоположение видео в папке видео и имена видео в видеофайлых. Укажите границы летной арены в настройках арены на основе координат пикселей x/y нескольких точек на краю арены.

Конкретное расположение неактивных красных светодиодов в светодиодных настройках, на основе координат пикселей x/y расположения центра светодиодов. Чтобы проверить расположение границ лету арене, установить отладку, чтобы верно в настройках арены, нажмите сохранить, и запустить сценарий в терминале. Захват экрана видео появится с синим квадратом, сформированным координатами, вводимыми в настройках арены.

Затем измените отладку в настройках арены на ложную. Нажмите сохранить, и запустить экран в терминале снова, чтобы начать процесс отслеживания. В типичном температуре поведенческого эксперимента, одиночные мухи подверглись действию до 16, 20, или 24 градусов celsius exhibit более высокое движение в начале эксперимента, чем после 5 минут.

Арену, контролируемую температурой, также можно использовать для сравнения поведенческих реакций мух различных генетических фонов с динамическими изменениями температуры. Например, в этом эксперименте скорость всех проверенных видов увеличивалась в соответствии с их собственными кривыми реакции по мере повышения температуры, до достижения точки максимальной производительности, после чего их скорость разлагалась и мухи гибли. Когда отдельные мухи подвергались воздействию 40 градусов по Цельсию в середине и одной боковой плитки, с другой стороны плитки на удобные 22 градусов по Цельсию диких мух типа быстро перестал двигаться вдоль арены и остаются в удобном месте.

В отличие от этого, классический мутант памяти Dunce мухи продолжают исследовать арену и тратить меньше времени, чем элементы управления в удобном месте. Кроме того, тестирование комбинаций температуры и местоположения также полезно для понимания функции различных температурных рецепторов во время динамических изменений температуры. Как показано в этом эксперименте, в котором отдельные мутанты d melanogaster подвергались воздействию повышения температуры в то время как изменение комфортное расположение на 22 градусов по Цельсию также было предоставлено.

Выполняя эти процедуры, не забудьте выполнить шаги в порядке и быстро, так что вы можете захватить как можно больше поведения мух, как это возможно. Рядом с этой процедурой другие методы, такие как отрицательный геотаксис или теплодушие анализы могут быть использованы для ответа на дополнительные вопросы, такие как, где мухи двигаться нормально или имеют нормальную теплостойкость. Последствия этого метода распространяются на нас понимание неврологических расстройств или мутаций, в которых восприятие температуры или боль играют определенную роль.

Как правило, люди, новые для этого метода будет бороться, потому что каждый шаг прост сам по себе, но они должны быть прекрасно скоординированы, поэтому техника должна быть отработана.