qKAT: количественные Semi-automated типирование убийца клетки генов иммуноглобулинов подобных рецепторов
6 марта 2019 г.
Количественные клеток-киллеров иммуноглобулина подобный рецептор (KIR) полуавтоматические ввод (qKAT) является простой, высокой пропускной способности и экономически метод, чтобы скопировать номер типа Кир генов для их применения в ассоциации исследований населения и болезней.
Этот метод может ответить на ключевые вопросы о генетике рецепторов НК-клеток, таких как разнообразие гаплотипа и как это связано с болезнью. Визуальная демонстрация этого метода поможет установить протокол в лаборатории, включая процесс автоматизации и анализ данных. Основными преимуществами этого метода являются то, что, в отличие от обычных методов, qKAT, который выступает за количественный KIR автоматизированного ввода, является высокой пропускной способностью и обеспечивает номер копии гена.
qKAT может дать представление об ассоциации болезней. Последствия этого метода могут быть полезны для терапии вирусных инфекций, таких как ВИЧ и гепатит С, при раке, при трансплантации стволовых клеток и нарушениях беременности. qKAT также может быть применен при изучении генетики популяции, а также в изучении экспрессии и функциональных взаимодействий между молекулами KIR и HLA.
qKAT состоит из 10 мультиплексных реакций, которые специально нацелены на экзоны двух генов KIR и одного эталонного гена. В этом протоколе, конкретные грунтовки предназначены для обнаружения аллелей данного гена и PCR результаты в коротких ампликонов. После этого для мониторинга усиления ПЦР в режиме реального времени используются специальные гидролизные зонды с двойной маркировкой.
Анализ числа копий использует относительную количественную оценку целевых генов KIR для эталонного гена. qKAT разработан и настроен как высокая пропускная способность. Таким образом, каждая реакция может быть выполнена на чуть менее 1000 образцов.
Следующие шаги показывают шаги, участвующие в подготовке и покрытие из каждого 96-хорошо пластины ДНК. Для начала, после количественной оценки ДНК, разбавить ДНК в 96-ну глубокой пластины. Включите по крайней мере один образец управления с известным номером копии и один элемент управления без шаблона.
Центрифуга пластины на 450 г в течение двух минут. Затем, обойтись каждый образец в четыре раза в 384-хорошо qPCR пластин. После этого воздух высушит ДНК в чистом месте при комнатной температуре в течение 24 часов.
Чтобы настроить одну реакцию qKAT для 10 пластин 384-колодец, во-первых, разморозить буфер qPCR, грунтовка, и зонд aliquots на четыре градуса по Цельсию. Подготовь мастер-микс на льду в соответствии с текстовым протоколом. Затем используйте многоканаражную пипету для равномерного распределения мастер-микса по 96-ну глубокой пластине.
Выпределите 9,5 микролитров мастер-микса в каждый колодец пластины с высушенными образцами ГДНК. После этого, печать пластины с фольгой и сразу же хранить его при четырех градусах по Цельсию. Не забудьте выполнить короткую промывку воды, чтобы очистить иглы жидкой системы обработки, если дозирование мастер смеси на более чем одной 384-хорошо пластины ДНК.
Центрифуга пластины с образцами ГДНК на 450 г в течение трех минут. Затем инкубировать пластину при 4 градусах по Цельсию, чтобы повторно использовать ДНК и рассеять любые пузырьки воздуха. После инкубации пластины на ночь, повторите центрифугу, чтобы рассеять любые пузырьки воздуха.
Затем поместите тарелку в охлажденный док для хранения. Подключите машину qPCR к обработчику микроплатформ. Затем запрограммировать обработчик микроплатформ в соответствии с текстовым протоколом.
После завершения пробега, закажите робота, соберите пластину из машины qPCR и поместите ее в док-станцию. После завершения усиления откройте программное обеспечение qPCR. Под вкладкой Navigator откройте файл эксперимента сохраненной реакции для пластины.
Затем откройте окно Create New Analysis и выберите подходящие настройки для второго метода производного Max. Затем выберите Гребень фильтра и убедитесь, что данные, собранные для STAT6, выбраны. Выберите соответствующую цветовую компенсацию.
Нажмите Рассчитайте, а затем нажмите сохранить файл. Для анализа данных с помощью метода Fit Points откройте новое окно анализа и выберите подходящие настройки для метода Fit Points. Затем выберите правильные фильтры и цветовые компенсации для STAT6.
Установите шумовую полосу, чтобы исключить фоновый шум. После этого откройте вкладку Анализ и установите подходящие точки до трех, а также выберите Show Fit Points. Сохранить изменения и повторить шаги с соответствующими настройками для Fit Point и 2-й производный анализ для генов KIR.
Откройте вкладку Navigator в программном обеспечении qPCR и выберите результаты экспорта пакетов. Затем откройте папку, содержащую файлы эксперимента, и перенесите их на правую сторону окна. Нажмите далее и выберите имя и местоположение экспортного файла.
После этого выберите тип анализа интереса и нажмите Далее. Убедитесь, что имя файла, экспортная папка и тип анализа являются правильными, прежде чем нажать Далее, чтобы начать процесс экспорта. Когда статус экспорта изменяется до OK, экран автоматически переходит к следующему шагу.
Убедитесь, что все выбранные файлы были успешно экспортированы и нажмите Готово. Затем используйте скрипты в текстовом протоколе, чтобы разделить экспортируемые пластины на отдельные реакции и преобразовать файлы в программное обеспечение, читаемое программным обеспечением для анализа номеров копий. Затем откройте программное обеспечение для анализа номеров копий и выберите файл результатов Import в режиме реального времени для загрузки текстовых файлов, созданных скриптами.
Наконец, выберите анализ и проведем анализ, выбрав наиболее частый номер копии образца. В этом протоколе для копирования генов KIR был использован полуавтоматический тип ввода, или qKAT. Наиболее частым номером копии KIR2DL4 было два экземпляра, в то время как наиболее частый номер копии для KIR3DS1 был нулевым.
При попытке этой процедуры, крайне важно убедиться, что ДНК количественно точно, провести все шаги на льду, и убедиться, что реагенты покрыты от света. Важно также провести тщательную проверку необработанных данных для образцов, которые не соответствуют известным правилам LD для генов KIR. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как секвенирование, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, наличие генов синтеза или идентификация новых аллелей.
После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области иммуногенетики, чтобы исследовать роль KIR в биологии клеток НК, устойчивость к болезням, и воспроизводства человека.
Обзор
Количественное полуавтоматическое типирование киллер-клеточных иммуноглобулиноподобных рецепторов (qKAT) представляет собой высокопроизводительный метод типирования генов KIR. Данный метод помогает понять генетику рецепторов NK-клеток и ее значение при различных заболеваниях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммуногенетика
- Популяционная генетика
- Клеточная биология
Теоретическая часть
- Гены KIR играют ключевую роль в иммунном ответе.
- Понимание гаплотипического разнообразия важно для исследований ассоциаций с заболеваниями.
- Традиционные методы часто характеризуются низкой пропускной способностью и высокой стоимостью.
- Метод qKAT позволяет эффективно получать информацию о числе копий генов.
Цель исследования
- Разработать высокопроизводительный метод типирования генов KIR.
- Изучить взаимосвязь между генетикой KIR и заболеваниями.
- Способствовать проведению исследований в области иммуногенетики и популяционных исследований.
Используемые методы
- Разработка специфических праймеров для детекции генов KIR.
- Использование мультиплексных реакций, нацеленных на гены KIR и референсный ген.
- ПЦР в реальном времени для мониторинга амплификации.
- Анализ данных с помощью специализированного программного обеспечения для оценки числа копий.
Основные результаты
- qKAT позволяет обрабатывать почти 1000 образцов за один запуск.
- Были определены наиболее частые числа копий KIR2DL4 и KIR3DS1.
- Метод продемонстрировал надежность при количественном определении числа копий генов KIR.
- Это способствовало дальнейшему изучению роли KIR при различных заболеваниях.
Выводы
- qKAT является ценным инструментом для исследователей в области иммуногенетики.
- Он расширяет понимание функций генов KIR при норме и патологии.
- Данный метод может быть адаптирован для различных применений в популяционной генетике.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точное генотипирование полиморфных локусов иммунных рецепторов, таких как KIR, имеет решающее значение для снижения рисков при валидации мишеней в иммунологии и исследованиях в области трансплантации. Метод qKAT позволяет проводить анализ числа копий с высоким разрешением в больших когортах, что дает возможность получить mechanistic insights в механизмы устойчивости к заболеваниям, опосредованную NK-клетками, и терапевтический ответ. Эта возможность повышает прогностическую уверенность на ранних этапах поиска, связывая генетическую вариабельность с функциональными результатами в моделях заболеваний.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать вариации числа копий генов KIR для уточнения гаплотипического разнообразия и его влияния на функцию рецепторов NK-клеток.
- Практическая ценность: обеспечивает полуавтоматизированное высокопроизводительное генотипирование, совместимое с форматами на 96 и 384 лунки для масштабируемой обработки образцов.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает получение количественных, воспроизводимых данных о числе копий всех генов KIR с помощью мультиплексной ПЦР в реальном времени с использованием гидролизуемых зондов.
- Практическая ценность: способствует стандартизации анализа за счет нормализации по референсным генам и использования предопределенных рабочих процессов анализа (максимум второй производной, точки аппроксимации).
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: способствует изучению взаимодействий KIR-HLA в контексте таких заболеваний, как вирусные инфекции, рак и трансплантация.
- Практическая ценность: позволяет получать данные с информацией о гаплотипах, которые могут быть использованы в последующем секвенировании или функциональных анализах для поиска новых аллелей.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Метод qKAT встраивается в непрерывный процесс разработки — от проверки гипотез о мишенях до доклинической валидации, особенно в тех случаях, когда на терапевтическую эффективность влияют иммунные эффекторные механизмы.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез путем установления связи между числом копий KIR и активностью NK-клеток при фенотипах, ассоциированных с заболеваниями.
- Скрининг: Позволяет создавать готовые к использованию биологические системы с определенными генотипами KIR для скрининга соединений в моделях иммуноопосредованных процессов.
- Аналитика: Предоставляет данные относительного количественного анализа, подходящие для определения числа копий и статистического сравнения между экспериментальными группами.
- Трансляционные исследования: Связывает генетическое профилирование с доклиническим этапом в моделях иммунной реконституции или реакции «трансплантат против хозяина».
- Корпоративное повторное использование: Разработано как универсальная платформа для генотипирования, применимая в портфелях исследований по иммунологии, онкологии и репродуктивному здоровью.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность при валидации иммунных мишеней за счет высокоразрешающего генетического профилирования полиморфных локусов.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет стандартизированной работы с реагентами, подготовки мастер-микса в условиях холодовой цепи и автоматизированной обработки планшетов.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет возможности проведения крупномасштабной генетической стратификации в исследованиях на ранних фазах.
- Влияние на портфель: Поддерживает продвижение проектов с учетом рисков путем идентификации гаплотипов KIR, связанных с различным ответом на лечение.
Особенности реализации
- Требуется опыт в постановке ПЦР в реальном времени, разработке праймеров/зондов и использовании программного обеспечения для анализа числа копий.
- Зависит от наличия оборудования для qPCR, совместимого с 384-луночными планшетами, и автоматических манипуляторов микропланшетов.
- Необходима межкомандная стандартизация количественного определения ДНК, единообразие при распределении по лункам и контроль загрязнений.
- Требуется учитывать особенности адаптации при переходе на нечеловеческие модели или альтернативные референсные гены.
- Включает практические ограничения, такие как необходимость точного количественного определения ДНК, использование реагентов, защищенных от света, и контроль качества необработанных данных для соблюдения правила LD.
