Обнаружение на основе тромбоцитов оксида азота в крови путем измерения VASP фосфорилирование

Этот протокол рассматривает потенциальное использование тромбоцитов в качестве высокочувствительных датчиков оксида азота как в пробирке, так и in vivo в крови. Повышенный фосфорилированный вазодилататор-stimulated Фосфопротеин или P-VASP серин 239 в тромбоцитах оксида азота имеет некоторые преимущества, в том числе способность обнаруживать наличие оксида азота в наномолярных линий. В течение двух часов после сбора от 30 до 50 миллилитров цельной крови от здорового донора, добавить пять миллилитров aliquots крови в соответствующее количество 15 миллилитров конических труб для центрифугации.

Используйте пластиковую трубу для передачи, чтобы тщательно собирать богатую тромбоцитами плазму из верхней части супернатантов. Пеллет богатые плазмой тромбоциты со второй центрифугации и аккуратно мыть гранулы в пять миллилитров буфера CGS. Центрифуга при температуре 400 г в течение 10 минут при комнатной температуре.

В конце центрифугации, перерасход гранул в трех миллилитров модифицированного буфера Тирод. Используйте гемоцитометр для подсчета и регулировки плотности суспензий тромбоцитов в три раза от 10 до восьмого ячейки на миллилитр в свежем буфере Тирода. Затем инкубировать суспензии тромбоцитов в течение одного часа при 37 градусах по Цельсию.

Между тем, собирать красные кровяные тельца из пластины свободных плазменных слоев всех образцов крови центрифугации следуют четыре моет в пяти миллилитров PBS за стирку. После последней стирки отбросьте супернатанты и смешайте эритроциты с одним миллилитром богатых плазмой тромбоцитов при соответствующем экспериментальном гематокрите в полипропилевых бутылках, закрытых резиновыми пробками. Вставьте иглу, соединенную с гелиевым газовым баллоном, в каждую септу и вставьте 26 игл калибра, чтобы сделать газовые розетки.

Затем медленно закружить бутылки при комнатной температуре и использовать оксиметр для измерения частичного давления кислорода для мониторинга процесса дезоксигенации. Скорость уменьшения кислорода зависит от скорости потока гелия и скорости перемешивания. Поэтому время оксигенации должно быть оптимизировано перед началом эксперимента, так как это сильно зависит от геометрии экспериментальной установки.

Для сокращения нитритов красных кровяных телец используйте микросиринг для введения нитрита через перегородку в дезоксигенированные образцы ПРП и РБК, чтобы достичь 10 микромоляров окончательной концентрации. Инкубировать образцы, по крайней мере 10 минут при 37 градусах по Цельсию и передачи одного миллилитра каждого образца в микроцентрифуг трубки для центрифугации. Перенесите 300 микролитров суспензии тромбоцитов из верхней части супернатантов в новые микроцентрифуговые трубки и добавьте кислотную цитратную декстрозу в каждую трубку в соотношении от одного до девяти.

Центрифуга тромбоцитов снова и повторно гранулы в 80 микролитров ледяной лиза буфер, содержащий ингибитор протеазы коктейль три к каждой трубке. Затем загрузите 15 микрограммов белка из каждого образца в два отдельных геля 10%SDS-PAGE. Вы запустите гели на 120 вольт в течение 1,3 часов.

В конце пробега перенесите гели на отдельные мембраны целлюлозы азота и блокируйте любые неспецифические связывания с соответствующим объемом 5% обезжиренного сухого молока. Инкубировать мембраны с соответствующими первичными антителами на ночь при четырех градусах по Цельсию, а затем маркировки с соответствующим вторичным антителом редиса пероксидаса в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем подвергайте мембраны с изображением для количественной оценки плотности полосы с соответствующей программой анализа изображений.

Здоровые образцы венозной крови имеют частичные значения давления кислорода от 50 до 80 миллиметров ртутного столба. Дезоксгенация гелием быстро снижает частичное давление кислорода до 25 миллиметров ртути в течение 10 минут. Дальнейшее снижение частичного давления кислорода может быть достигнуто с увеличением времени дезоксигенации.

Повышенная дезоксигенация приводит к повышению уровня гемолизиса, о чем свидетельствует все более красный цвет плазмы. Это эффект дезоксигенации и не вызвано перемешиванием себя, как указано на отсутствие гемолизиса в образцах перемешивают без гелия. Как вазодилататор-stimulated Фосфопротеин или VASP и фосфорилированных-VASP уровни экспрессии в тромбоцитах снизилась с увеличением гематокрита в дезоксигенированных образцов, как обнаружено западной пятно.

Лечение с недолговечным донором оксида азота увеличивает фосфорилированный сосудорасширяемый стимулируется экспрессии фосфопротеина в тромбоцитах в течение 10 секунд после лечения. Кроме того, уровни фосфорилированно-VASP или P-VASP оставались стабильными до 10 минут после инкубации ДОНОРА NO с богатой тромбоцитами плазмой, что указывает на то, что есть достаточно времени для отделения РБК от тромбоцитов, не влияя на существующие уровни P-VASP. Нитрит также повышает уровень P-VASP тромбоцитов в присутствии дезоксигенированных РБК.

Здесь соотношение P-VASP к общей VASP зависит от уровня гематокрита. VASP высоко выражен в тромбоцитах и быстро фосфорилируется в присутствии оксида азота. Таким образом, этот протокол предоставляет метод для изучения индукции оксида азота различными физиологическими стимулами.

С помощью этого метода мы успешно использовали увеличенный P-VASP в тромбоцитах в качестве маркера стимуляции оксида азота путем вдыхания нитрита in vivo. Не забывайте, что работа с тромбоцитами с биологическим образцом всегда должна выполняться с использованием соответствующего оборудования индивидуальной защиты.