Очистка H3 и H4 Гистоны и количественная оценка ацетилированный гистона знаков в клетках и тканях мозга
30 ноября 2018 г.
Цель этой статьи заключается в предоставления всеобъемлющей, систематической руководства для эффективной очистки гистонов H3 и H4 и количественная оценка остатков ацетилированный гистонов.
Этот метод позволяет точно оценить основные гистоны H3 и H4 и их пост-трансляционные модификации из клеточных и тканевых экстрактов, что, следовательно, приводит к генерации высококачественных, воспроизводимых результатов. Представленная техника имеет три основных преимущества. Во-первых, он сохраняет родные пост-трансляционные модификации гистонов.
Во-вторых, он обходит дорогие методы низкой пропускной способности. Наконец, он полностью совместим с приложениями средней пропускной способности ниже по течению. Демонстрация процедуры будет Каролина Janczura талантливый аспирант из моей лаборатории, который полностью оптимизировал этот протокол и использовал технику, чтобы ответить на важные вопросы, касающиеся эпигенетической регуляции в болезни Альцгеймера.
Для того чтобы начать плиту клетки в 10-сантиметровой ткани культур-обработанные тарелки с соотвествуя средствами культуры клетки согласно протоколу текста. Позвольте клеткам расти, пока они не достигнут около 90% слияния. После того, как клетки достигли желаемого слияния, аккуратно аспирировать культурные средства массовой информации и мыть клетки дважды с довоенной сыворотки свободных средств массовой информации.
После этого удалите из клеток безысовую сыворотку и поместите 10-сантиметровую посуду на лед. Добавьте один миллилитр ледяного буфера экстракции к каждому блюду. С помощью пластикового скребка ячейки собирают клетки в буфере извлечения и передают их в помеченную 1,5-миллилитровую трубку.
Затем поместите трубки на лед. При использовании замороженной ткани поместите ткань в предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку и ненадолго оттаивать ее на льду. Далее гомогенизируйте ткани мозга с помощью портативного гомогенизатора, используя рекомендуемое количество буфера экстракции и количество ударов.
Гомогенизация завершена, когда нет видимых фрагментов тканей и раствор приобретает молочный вид. После этого используйте одноканайную трубочку 1000-микролитров для переноса гомогената в предварительно охлажденную трубку 1,5 миллилитров и поместите трубки на лед. Поместите трубку, содержащую лизаты клетки и гомогенизированную ткань мозга, на вращающейся платформе, вращающейся при 15 РДМ при четырех градусах Цельсия.
После этого центрифуга трубки на максимальной скорости в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия. Затем перенесите супернатант в новую предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку и отбросьте гранулы. Затем нейтрализуйте гистоны с 1/4 томом буфера нейтрализации и смешайте с помощью трубок вверх и вниз.
Используйте полосы рН, чтобы проверить рН смеси, и далее настроить рН с буфером нейтрализации, если это необходимо. Если кислотные гистоны не нейтрализованы во время этого шага, они не будут связываться с мембраной столбца должным образом, пройдут через нее и будут обнаружены в пролете. Добавьте 37,5 микролитров образца в 12,5 микролитров буфера выборки.
После краткой центрифугации денатурации смесь при 99 градусах Цельсия в течение 10 минут. После этого поместите трубки на лед и спина их кратко собирать конденсат. Загрузите образец на гель SDS-PAGE и запустите гель на 100 вольт в течение одного часа.
Затем испачкать гель на ночь. И destain его в течение трех последовательных моет. Сначала добавьте 500 микролитров буфера эквилибрации к каждому столбецу спина.
Центрифуга колонны в течение трех минут. Откажитесь от сквозного потока и повторите центрифугу еще раз. После этого добавьте в столбец 500 микролитров образца.
Центрифуга колонны в течение трех минут и собирать поток через. Затем проанализируйте поток столбца, как описано ранее. Добавьте в столбец 500 микролитров буфера стирки.
Центрифуга колонны в течение трех минут и собирать поток через. Перенесите столбец на новую помеченную 1,5-миллилитровую трубку. Добавьте в столбец 50 микролитров буфера гистона elution.
После центрифугирования столбец спасает поток, содержащий гистоновые белки. Под химическим капюшоном добавить перхлорную кислоту в очищенные гистоны для достижения окончательной концентрации 4%перхлорной кислоты. Pipette вверх и вниз шесть раз, чтобы смешать.
Если гистоны в образце очень сконцентрированы, раствор станет облачным после добавления перхлорной кислоты. После этого инкубировать трубку при четырех градусах по Цельсию в течение 24 часов. Если ночь гистон осадков успешно, небольшой белый гранулы будут видны на дне флакона после шага центрифугации.
При мытье гранулы в последовательных шагов заверить гранулы не нарушается, как он может легко отделиться от флакона дна. На следующий день центрифуга образцов в течение 75 минут в предварительно охлажденных микроцентрифуг труб. Тщательно аспирировать супернатант и добавить 500 микролитров ледяной перхлорной кислоты в гранулированный образец.
После центрифугирования образца в течение 10 минут на максимальной скорости, аспирировать супернатант. Добавьте 500 микролитров ледяного ацетона в образец, чтобы не беспокоить гранулы. Затем удалите супернатант и дайте трубам высохнуть незакрытые на льду в течение 30 минут.
Затем снимите трубки со льда и дайте образцу высохнуть при комнатной температуре в течение пяти минут. После того, как гранулы высохнет повторно его в 30 микролитров стерильной воды. Крышка труб и позволяют гистоны восстановить на льду в течение 30 до 50 минут.
Проверив, что гранулы перерасходуются, повторите трубки и удалите их со льда. В этом протоколе были очищены гистоны из человеческих микроглиальных клеток BV-2 и проанализирован состав экстракта. Окрашенный гель показывает, что время извлечения от 15 минут до 24 часов не повлияло на общий состав экстрактов сырого гистона.
Эффективность связывания гистона с матрицей колонны была проанализирована с помощью окрашивания геля. Эффективность колонки была примерно на 100%, о чем свидетельствует отсутствие обнаруживаемых белков гистона в сквозной колонке. Независимо от продолжительности времени извлечения, т.е.
15 минут, два часа или 24 часа. первый столбец мыть устраняет наибольшее количество неистоновых белков из экстракта. Очищенные фракции белка гистона из 24-часовой группы экстракции содержали больше Г3 и H4 гистонов по сравнению с 15-минутным и двухчасовым временем экстракции.
В первой колонке elution был примерно 100%эффективным, о чем свидетельствует отсутствие гистона белков во втором элуат. Затем из всего мозга мыши были извлечены сырые гистоны, и были измерены пост-трансляционные модификации. В ответ на широко действующий ингибитор HADC, трибутирин, ацетилирование H4K12 увеличилось в экстракте.
Однако специфичность антитела снизилась из-за наличия примесей в сыром экстракте. Протокол очистки гистон был завершен с префронтальной коры тройной трансгенной A / D мышей, обработанных с классом I и IIb HDAC ингибитор, M344, и одно чистое ядро гистон фракция была оценена для изменений в H4K12 ацетилирования. Всего гистоны были обнаружены и значительное увеличение Ацетилирования H4K12 наблюдалось в ответ на M344.
При попытке этой процедуры важно помнить, чтобы выполнить несколько контрольно-пропускных пунктов, описанных в протоколе для проверки успешной очистки гистон на протяжении всего процесса. После этой процедуры могут быть решены дополнительные вопросы, касающиеся фосфорилирования гистона и состояния метилирования. Разработка этого метода проложила путь для исследователей в нашей лаборатории для анализа генетических механизмов, участвующих в болезни Альцгеймера.
Однако он может быть использован в различных моделях заболеваний, где хроматин модификации предполагается играть значительную роль.
Обзор
В данной статье представлен систематический метод очистки гистонов H3 и H4, а также количественного определения их ацетилированных остатков. Протокол, оптимизированный аспирантом, разработан для сохранения нативных посттрансляционных модификаций и совместим с приложениями средней пропускной способности, что делает его подходящим для исследований в таких областях, как эпигенетическая регуляция.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Клеточная биология
- Эпигенетика
Теоретическая часть
- Гистоны имеют решающее значение для упаковки ДНК и регуляции экспрессии генов.
- Посттрансляционные модификации гистонов важны для различных биологических процессов.
- Для прямого изучения этих модификаций необходимы эффективные методы очистки.
- Данное исследование направлено на устранение ограничений существующих низкопроизводительных методов.
Цель исследования
- Предоставить подробное руководство по очистке гистонов H3 и H4.
- Количественно определить ацетилированные остатки гистонов в экстрактах клеток и тканей.
- Получить высококачественные воспроизводимые результаты для содействия исследованиям эпигенетической регуляции.
Используемые методы
- Культивирование клеток и экстракция с использованием ледяных буферных растворов.
- Очистка гистонов с помощью колоночной хроматографии и SDS-PAGE.
- Нейтрализация гистонов для обеспечения правильного связывания с колонкой и их последующего извлечения.
- Поэтапные процедуры, включающие гомогенизацию, центрифугирование и элюцию для оптимального выделения гистонов.
Основные результаты
- Данный протокол обеспечивает почти 100% эффективность связывания и очистки гистонов.
- Время экстракции влияет на выход гистонов: более длительная экстракция приводит к более высокому выходу H3 и H4.
- Полная очистка позволяет проводить анализ ацетилированных гистонов в рамках эпигенетических исследований.
Выводы
- Данный метод демонстрирует эффективную стратегию очистки гистонов, позволяющую сохранить их нативные модификации.
- Этот метод может быть адаптирован для анализов со средней пропускной способностью, что расширяет исследовательские возможности в области эпигенетики.
- Результаты имеют важное значение для понимания модификаций гистонов при различных моделях заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный метод позволяет надежно количественно определять уровни ацетилирования гистоновых меток в экстрактах клеток и тканей головного мозга, что способствует валидации мишеней при поиске эпигенетических лекарственных средств. Благодаря сохранению нативных посттрансляционных модификаций, данный подход расширяет возможности анализа механизмов действия и снижает риски в доклинических исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Совместимость протокола с рабочими процессами средней пропускной способности повышает прогностическую достоверность при поиске соединений-лидеров.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичное открытие и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет изучать ацетилирование гистонов в качестве механистического биомаркера транскрипционной регуляции в моделях заболеваний.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимое выделение основных гистонов H3 и H4 для функциональной оценки мишеней.
- Прогностическая ценность: позволяет оценивать эффективность ингибиторов HDAC с помощью количественного анализа ацетилирования.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать очищенные гистоновые субстраты, подходящие для анализа ацетилирования с помощью антител или масс-спектрометрии.
- Операционная ценность: обеспечивает эффективность связывания с колонкой, близкую к 100%, что гарантирует стабильное количество исходного материала для последующего количественного анализа.
- Масштабируемость: совместимость с приложениями средней пропускной способности позволяет проводить скрининг библиотек соединений, нацеленных на эпигенетические модификаторы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: облегчает сопоставление биомаркеров путем количественного определения изменений ацетилирования в тканях мозга в ответ на заболевание.
- Релевантность доклинических моделей: продемонстрированная эффективность в трансгенных моделях болезни Альцгеймера, получавших ингибиторы HDAC.
- Развитие с учетом рисков: позволяет объективно оценить взаимодействие с мишенью и модуляцию сигнальных путей перед проведением исследований in vivo.
Интеграция в конвейеры и рабочие процессы
Данный метод вписывается в континуум от раннего поиска до доклинических исследований, обеспечивая проверку гипотез, готовность анализа и принятие решений на основе данных в программах по эпигенетическим мишеням.
- Открывающая биология: обеспечивает функциональную валидацию ацетилирования гистонов как регуляторного узла при ремоделировании хроматина.
- Скрининг: позволяет получать количественные, воспроизводимые экстракты гистонов для оценки влияния соединений на метки ацетилирования.
- Аналитика: обеспечивает точное измерение ацетилированных остатков, предоставляя критически важные данные о модуляции мишени.
- Трансляционные исследования: связывает результаты in vitro с доклиническими моделями посредством последовательной очистки гистонов из клеточных и тканевых источников.
- Корпоративное повторное использование: создает стандартизированную, многократно используемую платформу для количественного определения эпигенетических биомаркеров в различных проектах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность выводов о механизме действия мишени за счет сохранения нативных ПТМ в процессе очистки.
- Операционная ценность: устраняет вариабельность, характерную для низкопроизводительных методов, что повышает воспроизводимость анализа.
- Стратегическая ценность: снижает биологическую неопределенность при выборе эпигенетических мишеней, повышая качество принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go).
- Влияние на портфель: позволяет проводить стратифицированную по риску приоритизацию эпигенетических модификаторов на основе количественных данных о модуляции мишени.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области биохимии белков и эпигенетического анализа.
- Зависимость от наличия оборудования для центрифугирования, электрофореза и колоночной хроматографии.
- Необходимость использования стандартизированных протоколов нейтрализации и экстракции для обеспечения извлечения гистонов.
- При адаптации метода к различным доклиническим моделям необходимо учитывать тканеспецифические переменные.
- Ограничение, связанное с необходимостью осторожного обращения с образцами для предотвращения деградации гистонов на этапах кислотного осаждения.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
1:06
Preparation of the Sample Extract
2:38
Preparation of the Crude Histone Extract
3:33
Evaluation of the Presence of Histone and/or Non-histone Protein in Histone Extract
4:14
Purification of Core Histones
5:13
Precipitation of Core Histones
7:02
Results: Human Microglial BV2 Histone Purified and Quantification in Wild Type and Transgenic Mouse Brain
9:02
Conclusion
