Microfluidic Assay для оценки лейкоцитарной адгезии к человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных эндотелиальных клеток (hiPSC-ECs)

Этот шаг за шагом протокол содержит подробное описание экспериментальной установки и анализ данных для оценки воспалительные реакции в hiPSC-ECs и анализ лейкоцитарной адгезии при физиологических потока.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии плюрипотентных стволовых клеток человека о функциональности и воспалительных реакциях индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток эндотелиальных клеток. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает подробное описание экспериментальной установки и анализа данных для оценки лейкоцитов адгезии человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных эндотелиальных клеток. Для покрытия микрофлюидных чипов поместите стерильный биочип в 10-сантиметровую стерильную чашку Петри и используйте наконечник пипетки 10-микролитров для впрыскив 10 микролитров свежеприготовленного фибронектина в каждый канал биочипа.

Обложка чашку Петри и поместите его в увлажненной камере на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующее утро, предварительно разогреть биочип в 37-градусный инкубатор по Цельсию, и вновь приостановить человека индуцированной плюрипотентных стволовых клеток полученных эндотелиальных клеток, собранных из 80 до 100% конвекциозной клеточной культуры в желаемой концентрации в свежей эндотелиальной клеточной сыворотки свободной среде. Далее, аспирировать раствор фибронектина из всех каналов микрофлюидного чипа, и тщательно перемешать клетки, чтобы получить однородную подвеску клетки перед использованием 10-микролитровый наконечник пипетки для введения шести микролитров клеток в каждый канал.

Изучите биочип под микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки равномерно распределены с высокой плотностью клеток. Через 15 минут при 37 градусах цельсия добавьте 40 микролитров эндотелиальной клеточной сыворотки в средние резервуары по обе стороны каждого канала. И верните биочип в инкубатор на час.

Затем добавьте еще 50 микролитров эндотелиальной клеточной сыворотки в резервуары по обе стороны каждого канала. Для живой визуализации сеяных клеток, подтвердите, что микрофлюидные установки готовы, что живая камера изображения equilibrated до 37 градусов по Цельсию, и что уровень CO2 достиг 5%Поместите биочип в держатель чипа микроскопа и смонтировать держатель чипа на стадии визуализации микроскопа. Чтобы подключить биочип к насосу через многообразие, поместите восьмикомпюйный адаптер рядом с резервуарами розетки чипа и углубите все булавки в среде, не соединяя булавки полностью.

В программном обеспечении микрофлюидного насоса, выберите Washout / Подключение к чипу, и нажмите Run Assay Step, чтобы обойтись 30 микролитров RPMI среды через каждый контактный. Затем вставьте восьмикоимперный адаптер в розетку биочипа. Используйте пипетку, чтобы вручную аспирировать среду из всех входных резервуаров биочипа, и выберите Washout/Chip Washout и Run Assay Step, чтобы просмотреть один канал одновременно с 40 микролитров эндотелиальной клеточной сыворотки, свободной от среды Full, чтобы удалить любые мертвые клетки и мусор.

При промывке всех каналов заменяют среду из входного резервуара канала интереса 100 микролитров лейкоцитов человека, разбавленных до 2,5 раза от 10 до шести клеток на миллилитр концентрации в среде RPMI. Нажмите Cell Assay/Step описание и установите текущее описание канала/шага и установите канал интереса к On и другим семи каналам, чтобы выключить. Выберите описание шага анализа ячейки и нажмите Run Assay Step.

Замените оставшиеся лейкоциты в входе резервуара на 100 микролитров полной среды RPMI. И нажмите Cell Assay Step описание и запустить анализ шаг, чтобы пронизать канал в течение пяти минут с RPMI среды для удаления каких-либо неадхерентных лейкоцитов. Затем приобрети изображения, по крайней мере, из трех-четырех различных позиций в канале, чтобы визуализировать прилипаемые лейкоциты.

Для количественной оценки адепт лейкоцитов откройте программное обеспечение для обработки изображений CellProfiler и импортируют файл конвейера Count Leukocytes Pipeline. Под входные модули выберите изображения и перетащите папку с необработанными изображениями адепта лейкоцитов в окно списка файлов. В рамках анализа модули выбирают определить первичные объекты и указать минимальные и максимальные диаметры адепта лейкоцитов в пикселях.

Под аналитические модули выберите FilterObjects. Затем выберите критерии фильтрации и введите минимально принятую область объектов в пикселях и нажмите Analyze Images, чтобы начать анализ. Оптимальная индуцированная человеком плюрипотентная стволовая клетка эндотелиальной диссоциации клеток должна привести к одной клеточной подвеске, свободной от клеточных комков.

Как правило, через 15 минут после инъекции эндотелиальные клетки прикрепляются к нижней части канала и начинают распространяться. В течение одного часа после инъекции эндотелиальные клетки должны образовывать хорошо распространяемый монослой через канал, после чего они готовы к использованию в анализе потока. Использование бесплатного программного обеспечения для обработки изображений с открытым исходным кодом, как это было продемонстрировано, позволяет фильтровать идентифицированные объекты на минимальной площади, а также исключить ложно идентифицированные объекты, такие как клеточный мусор, аутофторесценция или любой другой неспецифический флуоресцентный сигнал.

При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы оптимизировать стимуляцию с провоспалительными цитокинами и включить первичных человеческих пупочной вены эндотелиальных клеток в качестве положительного контроля. Не забывайте, что работа с первичными линиями клеток млекопитающих и клеток может быть чрезвычайно опасной и что такие меры предосторожности, как ношение лабораторного пальто, перчаток и защиты глаз, всегда должны приниматься при выполнении этой процедуры.