В естественных условиях Целевые выражение Optogenetic белков с помощью шелка/AAV фильмы

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области системной нейронауки. Например, как активность нейронных ансамблей поддерживает сенсорную и когнитивную обработку в головном мозге. Основным преимуществом этого метода является то, что он облегчает точное таргетинг оптогенетических белков, таких как родопсин Чан и GCaMP в области мозга, представляющие интерес, не требуя отдельной процедуры инъекции вируса.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как осаждение шелка и вируса небольшими оптическими имплантатами может занять некоторую практику для достижения воспроизводимых результатов. Во-первых, смесь талой AAV и пять-семь точки пять процентов aqueous шелка фиброина в соотношении один к одному в 200 микролитров ПЦР трубки. Аккуратно пипетка раствор в и несколько раз тщательно перемешать AAV и фиброин.

Чтобы отгрузить шелк/AAV, загрузите инъекционные пипетки с количеством раствора, необходимого для количества волоконных имплантатов, которые будут изготовлены, плюс примерно на 30 процентов дополнительно для размещения потерь из-за засорения пипеток. Затем смонтировать держатель ферруля в стереотаксисный аппарат, оснащенный микроинъектором. Поместите держатель феррула над микроинъектором и нанесите смесь шелка/AAV снизу.

Маневр инъекции пипетки, пока он не касается или почти касаясь центра поверхности оптического волокна, и извлечь от 10 до 20 нанолитров шелка / AAV решения. Затем свямите пипетки. Далее, наблюдать болюс шелка / AAV на плоской поверхности, которая появляется как жидкий купол, который высыхает до плоской пленки в течение примерно одной минуты.

Повторите предыдущие шаги до тех пор, пока желаемое количество шелка/AAV не будет отложено. При подготовке нескольких имплантатов, применить шелк / AAV решение одного имплантата, а затем перейти к пальто других имплантатов, прежде чем вернуться к первому. После одного часа сушки, поместите весь держатель феррулы в вакуумную камеру и вакуум высасывать на ночь примерно при 125 торр и четыре градуса по Цельсию.

На следующий день оцените форму и положение полученной шелковой пленки под высокой мощностью микроскопа. Убедитесь, что пленки ограничены кончиком поверхности оптического волокна, относительно тонкие и симметричные. Для покрытия конические оптические волокна, положение шелка / AAV инъекции пипетки против стороны оптического волокна в начале конуса, убедившись, что пипетка касается оптического волокна.

Выброс 20 нанолитров шелка / AAV, чтобы начать процесс покрытия, гарантируя, что капля придерживается оптического волокна и остается на стыке волокна и пипетки. Аккуратно фитиль капли к концу волокна кончика, как шелк / AAV высыхает, и держать инъекции пипетки в контакте с сушки капли, чтобы избежать засорения кончик пипетки. Когда первый болюс почти полностью высохнет, выбросите еще 20 нанолитров и продолжайте wicking капли вдоль конуса.

Повторите предыдущий шаг, выбросив небольшое количество шелка / AAV, и постепенно сушки раствора вверх по стороне конуса. После высыхания оцените форму и положение полученной шелковой пленки под высокой мощностью микроскопа. Для покрытия имплантатов объектива GRIN, депозит шелка / AAV в одной инъекции на имплантат объектива GRIN.

После высыхания оцените форму и положение полученной шелковой пленки под высокой мощностью микроскопа, чтобы пленка покрывала поверхность хрусталика. Для покрытия стеклянных черепных окон, ручная пипетка пятимикролитровая капля шелка/AAV на поверхность трехмиллиметрового круглого покрытия скользит так, что капля распространяется, чтобы покрыть всю стеклянную поверхность. После высыхания храните оптические волокна, покрытые шелком/ААВ, в охлажденные вакуумные децикаторы при 125 торре и четыре градуса по Цельсию до имплантации приборов.

Флуоресценции изображения флюорофора помечены оптогенетических белков при условии измерения степени выражения шелка / AAV фильмов, и типичные оптические волокна могут легко разместить 200 нанолитров шелка / AAV. С практикой, экспериментаторы могут достичь очень надежного выражения вокруг кончика имплантированных волокон. Две возможные проблемы с покрытыми черепными окнами являются недостаточным выражением, и шелковые пленки, которые не растворяются, и скрыть поле зрения.

Для увеличения экспрессии, durectomy может быть выполнена до имплантации окна, и / или увеличение количества вируса в фильме. Лучшее выражение было достигнуто с помощью одного-четырех смеси шелка и фондового titer AAV, соответственно. Количество шелка в окнах с покрытием в 10-100 раз больше, чем на волоконных имплантатах, и пленка менее встроена в ткани, и, таким образом, не может подвергаться воздействию тех же уровней протеолитической активности, которые могут растворять шелковые пленки.

Тем не менее, наличие шелка имеет важное значение для достижения вашего выражения под окнами, вероятно, потому, что пленка из вируса в одиночку смывается интерстициальной жидкости во время операции. При попытке этой процедуры, важно подготовить и хранить шелковые имплантаты в том, как мы описываем. Неправильное хранение может изменить свойства шелковых пленок или снизить эффективность векторов вирусного экспрессии.

Этот метод может быть большим полезности для исследователей в области систем неврологии, чтобы исследовать, как нейронная активность диски сенсорной и когнитивной обработки в мозге млекопитающих, таких как мыши, крысы, или даже нечеловеческих приматов. Не забывайте, что работа с переносчиками вирусного экспрессии может быть опасным и личное защитное оборудование, такое как перчатки, очки и лабораторные пальто, всегда следует носить во время работы с вирусом Адено.