Идентификация мыши и репертуаров человека антитела путем Sequencing следующего поколения
15 марта 2019 г.
Здесь мы описываем протоколы для анализа и визуализации структуры и Конституции репертуаров всего антитела. Это включает в себя приобретение огромные последовательностей РНК антитела, с помощью следующего поколения последовательности.
В этом видео мы описываем простой и эффективный метод визуализации и анализа репертуара антител на глобальном уровне. Можно описать весь репертуар В-клеток у людей и их динамические изменения в ответ на иммунную стимуляцию. Этот метод может быть применен для анализа патологических образцов у пациентов возникающих вирусных инфекций и для получения данных с беспрецедентным пониманием патогенеза инфекции.
Одной из наиболее интересных областей для применения является контроль вакцины. Эффективность вакцины можно оценить путем анализа динамики глобального репертуара антител у лиц, управляемых вакцинами. Индивидуум нов к этому методу может оптимизировать условия PCR потому что эффективность усиления гена антитела зависит на типах стартовых материалов.
Фла-шер для идентификации иммуноглобулинов. Важно продемонстрировать эти действия визуально. Демонстрация процедуры будет мисс Саюри Ямагути и г-н Ханбин Сюэ, техник и аспирант из моей лаборатории.
Чтобы начать эту процедуру, вскрыть ткань из восьминедельной C57 черный шесть мыши и передать его через сетку из нержавеющей стали с двумя миллилитров PBS для получения рассеянных клеток. Перенесите подвеску клетки в двухми миллилитровую микроцентрифугную трубку и центрифугу при 600 г и при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и добавьте 800 микролитров буфера лизайного ACK к грануле.
Инкубировать на льду в течение двух минут, чтобы подысать красные кровяные тельца в ткани. Далее, мыть клетки тканей три раза с помощью трех миллилитров PBS для каждой стирки. Центрифуга снова в 600 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Откажитесь от супернатанта и добавьте 800 микролитров фенола/гуанидина изотиоцианата реагента в гранулы и вихрь тщательно. Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение пяти минут. Затем добавьте 200 микролитров хлороформа и встряхните вручную в течение 15 секунд.
Инкубировать при 25 градусах по Цельсию в течение двух минут. Центрифуга при 12 000 раз г и при 25 градусах по Цельсию, чтобы отделить фазы. Перенесите верхнюю aqueous фазу к свежей пробке.
Добавьте один том 70% этанола. Vortex кратко и применить эту смесь к колонке кремнезема спина. Утете РНК с 30 до 100 микролитров воды.
После этого используйте флюорометр для количественной оценки начальной концентрации РНК. Храните очищенную РНК при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Во-первых, синтезировать первую прядь cDNA от двух до 10 микрограммов общего шаблона РНК с помощью 5'RACE CDS грунтовки и олигонуклеотида SMART-PCR в соответствии с инструкциями производителя.
Для мыши иммуноглобулин, ПЦР усиливают cDNA с высокой точностью ДНК полимеразы, используя универсальный вперед грунтовки и иммуноглобулин класса конкретных обратных грунтовки, как указано в текстовом протоколе. Для иммуноглобулина человека, выполнить первый ПЦР с использованием универсального вперед грунтовки и иммуноглобулин класса конкретных обратных грунтовки с тегами последовательностей. Включите последовательности индексов для каждого образца по второму ПЦР с использованием праймеров последовательность индексов.
Далее, электрофорез любой из продуктов ПЦР на 2%agarose гель. Визуализуй ДНК-полосы на уф-трансиллюминаторе и вырежьте ломтик геля, содержащий широкую полосу между 600 и 800 базовыми парами. Добавьте 10 микролитров мембранно-связывающего раствора на 10 миллиграммов ломтика геля.
Смешайте и инкубировать при 50 до 65 градусов по Цельсию, пока гель ломтики полностью растворяются. Затем перенесите раствор геля на колонку вращения кремнеземной мембраны. Вымойте столбец один раз с помощью буфера для мытья и утехи ДНК с помощью 50 микролитров воды без нуклеазы.
Используя флюорометр, количественно очищаемые ампликоны и объединить ампликоны из каждого класса иммуноглобулина в равных количествах для секвенирования NGS. После этого используйте микрокапильярий на основе электрофореза с чипом размеров ДНК для определения размера и концентрации библиотек. Храните библиотеки при температуре минус 20 градусов по Цельсию.
Во-первых, создать образец таблицы секвенирования запуска, как указано в текстовом протоколе. Далее оттаивать реагент картриджа и библиотек. Сделайте 0,2 нормального раствора гидроксида натрия и разбавьте библиотеки, чтобы получить желаемые концентрации моляров.
Затем прополощите и высушите ячейку потока и добавьте 600 микролитров разбавленного и денатурированного библиотечного раствора в колодец картриджа реагента и начните секвенирование. Перспектива murine антител репертуара в целом могут быть получены из клеток или тканей, таких как селезенка, костный мозг, лимфатический узел, или крови. Здесь показаны репрезентативные результаты репертуаров световой цепи IgM, IgG1, IgG2c и иммуноглобулина из наивной селезенки мыши.
В V(D)J перестановки 3D V(D)J участок, размер каждого шара представляет собой относительное количество читает. Другими словами, он представляет собой количество мРНК антител в целых клетках группы В. 3D-сетка состоит из 110 иммуноглобулиных тяжелых генов цепи V, 12 генов иммуноглобулина тяжелой цепи D и четырех иммуноглобулиных тяжелых цепных J генов, которые выровнены, чтобы отразить их порядок на хромосоме.
Сюжет 2D VJ показывает профиль перестановки VJ в репертуаре IGL. Длина каждого бара представляет собой относительное количество считых. X-ось представляет 101 иммуноглобулин световой цепи V-каппа генов, и три иммуноглобулина световой цепи V-lambda генов, и Y-оси представляет собой четыре иммуноглобулина световой цепи J-каппа генов, и три иммуноглобулина световой цепи J-lambda генов.
Перспектива репертуара антител человека в целом может быть проанализирована из различных тканей, включая периферические моноядерные клетки крови или патологические ткани. Здесь показаны репрезентативные результаты IgM, Total IgG, Total IgA, IgD, IgE и IgL из нормальных периферических моноядерных клеток крови. Как и модель murine, репертуарный профиль перестановки V(D)J отображается на сюжете 3D V(D)J, в котором размер каждого шара представляет собой относительное количество считываний.
3D-сетка состоит из 56 генов иммуноглобулина тяжелой цепи V, 27 генов иммуноглобулина тяжелой цепи D и шести генов иммуноглобулина тяжелой цепи J, выровненных в порядке, в каком они появляются на хромосоме. Профиль перестановки VJ в репертуаре IgL изображен в сюжете 2D VJ, в котором длина каждого бара представляет относительное количество считываний. X-ось представляет собой 41 иммуноглобулиновую световую цепь V-каппа генов, и 32 иммуноглобулин световой цепи V-lambda генов, и Y-оси представляет собой пять иммуноглобулин световой цепи J-каппа генов, и пять иммуноглобулин световой цепи J-lambda генов.
В материале исследования этого протокола можно ехать небольшое количество отсортированных клеток по цитометрии потока или даже клочья патологических образцов. Однако потребуется тщательная оптимизация условий ПЦР. Поскольку выходная информация этого протокола огромна, грамотность в области биоинформатики поможет найти структуру сети антител.
Это приведет к глубокому пониманию иммунной системы.
Обзор
В данной статье представлен метод анализа и визуализации репертуаров антител с использованием секвенирования следующего поколения. Данный подход позволяет исследовать репертуары B-клеток и их изменения в ответ на иммунную стимуляцию, что дает представление об эффективности вакцин и патогенезе заболеваний.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Геномика
- Патология
Теоретические сведения
- Понимание репертуаров антител имеет решающее значение для оценки иммунного ответа.
- Секвенирование следующего поколения обеспечивает комплексный анализ генов антител.
- Этот метод может быть применен как к образцам от здоровых доноров, так и к патологическим образцам.
- Полученные данные могут быть использованы при разработке вакцин и стратегий лечения заболеваний.
Цель исследования
- Разработать протокол для визуализации и анализа репертуаров антител.
- Оценить динамику антительного ответа в различных контекстах.
- Создать основу для оценки эффективности вакцин.
Используемые методы
- Диссекция и обработка тканей мыши для выделения B-клеток.
- Экстракция РНК и синтез кДНК для амплификации генов антител.
- Секвенирование нового поколения (NGS) амплифицированных генов антител.
- Визуализация данных о репертуаре антител с помощью 3D- и 2D-графиков.
Основные результаты
- Успешная амплификация и секвенирование генов антител из образцов мышей и человека.
- Визуализация паттернов V(D)J-рекомбинации в репертуарах антител.
- Демонстрация динамических изменений иммунного ответа антител после вакцинации.
- Данные о составе репертуаров антител при норме и патологии.
Выводы
- Данный метод обеспечивает надежную основу для анализа репертуаров антител.
- Полученные результаты могут углубить понимание иммунного ответа и лечь в основу терапевтических стратегий.
- Этот подход применим в различных областях исследований, включая разработку вакцин.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Комплексное профилирование репертуаров антител мышей и людей с помощью секвенирования следующего поколения (NGS) обеспечивает беспрецедентное понимание иммунного разнообразия и динамики ответа. Эта возможность имеет решающее значение для снижения рисков на ранних этапах поиска, поддержки оценки вакцин и обоснования трансляционных исследований иммуноопосредованных заболеваний. Анализ репертуаров с высоким разрешением повышает точность прогнозов в ключевых точках биофармацевтических разработок в области иммунологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Обеспечивает глобальный анализ разнообразия B-клеток и механизмов иммунного ответа.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней путем картирования использования V(D)J-генов и клональной экспансии.
- Способствует снижению механистических рисков в программах поиска лекарственных средств, ориентированных на иммунологию.
Скрининг и разработка метода анализа
- Обеспечивает количественное высокопроизводительное определение частот генов антител для стандартизации анализа.
- Позволяет проводить воспроизводимое профилирование иммунных репертуарoв в различных биологических образцах и условиях.
- Поддерживает масштабируемый скрининг вакцин или терапевтических средств путем мониторинга сдвигов в репертуаре.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные иммунного репертуара с соответствующими биомаркерами заболеваний и стратегиями стратификации пациентов.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа открытия до доклинической валидации путем отслеживания иммунной динамики в ответ на стимуляцию или патологию.
- Поддерживает принятие решений о продвижении разработок в области иммунотерапии и вакцин с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод профилирования репертуара антител на основе NGS объединяет этапы от раннего поиска до трансляционных исследований, что позволяет принимать решения на основе данных на нескольких стадиях разработки.
- Биология открытий: обеспечивает высокоразрешающее картирование разнообразия антител для проверки гипотез и уточнения сигнальных путей.
- Скрининг: предоставляет количественные, воспроизводимые результаты для иммунного мониторинга и оценки готовности анализа.
- Аналитика: генерирует крупномасштабные наборы данных последовательностей и визуализации (3D V(D)J, 2D VJ графики) для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает изменения в репертуаре с патологическими состояниями или ответом на вакцинацию, что способствует поиску соответствующих биомаркеров.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемую и адаптивную платформу для анализа иммунного репертуара в рамках различных исследовательских программ.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность в программах, направленных на иммунную систему.
- Операционная ценность: Стандартизирует рабочие процессы иммунного профилирования и обеспечивает масштабируемость для высокопроизводительного анализа.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), а также распределение капитала за счет предоставления надежных данных об иммунном ответе.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию иммунологических активов и вакцин с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки подготовки библиотек NGS, оптимизации ПЦР и биоинформатического анализа.
- Необходим доступ к платформам высокопроизводительного секвенирования и вычислительной инфраструктуре.
- Требуется межкомандная стандартизация процессов обработки образцов и интерпретации данных.
- При оптимизации протокола метод применим к различным типам образцов, включая сортированные клетки и патологические ткани.
- Для управления крупномасштабными наборами данных репертуара и их интерпретации необходима биоинформатическая грамотность.
