Синтез и Bioconjugation тиоловых реактивной реагентов для создания сайта выборочно изменять Immunoconjugates
6 марта 2019 г.
В этом протоколе мы будем описывать синтез СТРУЧКИ, phenyoxadiazolyl метил на основе сульфона реагент для сайта селективные крепление грузов тиолы биомолекул, особенно антител. Кроме того мы будем описывать синтеза и характеристика бифункциональных хелатором СТРУЧКИ подшипника и его спряжение модель антитела к.
Этот протокол описывает синтез и применение PODS, новый реагент для сайта конкретных биоконъюгации белков и пептидов. Эта технология представляет собой заметное улучшение по сравнению с традиционными биосюргациями на основе малеймид-тиола. Самым большим преимуществом этой процедуры является простота, с которой изготовлен реагент.
Метод позволяет синтезировать реагент практически в любой лаборатории. В 10-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 100 миллиграммов аминокислоты оксадиазол тиол в трех миллилитров метанола. К раствору добавьте 360 микролитров диизопропилэтиламина и магнитный батончик.
Запечатайте колбу резиновой пробкой и перемешайте раствор в течение 10 минут при комнатной температуре. Используя одноми миллилитровый стеклянный шприц, проткните отверстие через резиновую пробку и быстро добавьте в смесь 32 микролитров идометанов. Разрешить смесь реагировать в течение 45 минут при комнатной температуре.
В 25-миллилитровой колбе круглого дна растворите 387 миллиграммов защищенной боком карбоксиновой кислоты в 10 миллилитров дихлорметана. К раствору добавьте 480 микролитров диизопропилетиламина, 264 миллиграмма ЭДКИ, 200 миллиграммов анилина и магнитного батончика. Запечатайте колбу стеклянной пробкой и дайте реакции перемешать в течение пяти дней при комнатной температуре.
Как только реакция будет завершена, перенесите реакционной смеси в сепараторную воронку, и мыть три раза с пятью миллилитров одной молярной соляной кислоты. Соберите органическую фазу и перенесите ее в разделительную воронку. Затем промойте органическую фазу одномолярным карбонатом натрия, за которым последует вода.
Затем соберите органическую фазу и добавьте сульфат магния, чтобы удалить любые следы воды. Затем профильтруйте смесь с помощью среднего стеклянного фрита. Используя роторный испаритель, удалите летучие растворители под пониженным давлением, чтобы позволить себе небелый твердый.
После этого, redissolve изолированных твердых в 10 миллилитров этилового ацетата. Затем осаждают продукт через постепенное добавление 30 миллилитров циклохексана. Фильтр решение с помощью среднего стекла фрит для получения продукта карбамат в качестве белого порошка.
В 10-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 30 миллиграммов карбамата в четырех миллилитров дихлорметана. Медленно добавьте в смесь 49 миллиграммов 70%-м-хлоропербензойной кислоты и магнитного батончика, и запечатайте колбу стеклянной пробкой. Перемешать раствор на ночь при комнатной температуре, в конечном итоге уступая желтую смесь.
На следующий день перенесите смесь в сепараторную воронку. Затем промыть смесь 0,1-молярным гидроксидом натрия, а затем водой. Соберите органическую фазу и добавьте сульфат магния, чтобы удалить любые следы воды.
Затем профильтруйте смесь с помощью среднего стеклянного фрита. В 25-миллилитровой круглой нижней колбе растворяют 30 миллиграммов карбамата в двух миллилитров дихлорметана. Добавить магнитный бар перемешать в смеси.
И 400 микролитров трифтороацетической кислоты и запечатать колбу стеклянной пробкой. Затем перемешать реакционной смеси при комнатной температуре в течение трех часов. Как только реакция завершена, удалите летучие веществ под пониженным давлением при комнатной температуре с помощью роторного испарителя для получения масляных остатков.
Растворите масляные остатки в семи миллилитров воды. И перенесите в разделительную воронку. Вымойте аковый раствор три раза с четырьмя миллилитров этилового ацетата.
В 1,5-миллилитровой микроцентрифуге трубки растворяют 10 миллиграммов PODS и 300 микролитров диметилсульфида. Затем добавьте в раствор 26 микролитров N, N-diisopropylethylamine. Растворите 15,2 миллиграмма DOTA NCS в 100 микролитров диметилфоксида и объедините раствор с раствором PODS.
Печать микроцентрифуг трубки, и позволяют реакции инкубировать на ночь при комнатной температуре. Далее разбавляют 61 микролитром раствора trastuzumab с 859 микролитров PBS в низко белке-связывающей 1,5-миллилитровой микроцентрифуге трубки. К этой смеси добавьте 6,7 микролитров свежеприготовленного 10-миллимолярского раствора TCEP в воду.
Добавьте в реакционной смеси 73 микролитров раствора PODS-DOTA по 1 миллиграмму на миллилитр. Наконец, запечатать трубку микроцентрифуга и инкубировать раствор в течение двух часов при комнатной температуре. Синтез PODS является надежным и надежным.
Депротеинация и замена аминофенил оксадиазола тиола позволили thioether один в количественной урожайности. Лигация thioether один и бок-защищенной карбоксиновой кислоты дали соединение два в 55%yield. Окисление позволило соединения три в 90% урожайности.
А удаление группы, защищающей бока, дало PODS в 98%-ной урожайности. Идентификация каждого продукта была подтверждена с помощью протонной ЯМР, углерода ЯМР и ms с высоким разрешением. Изотиоцианат-несущий вариант хелатора DOTA был соединен с подвесным амином PODS для получения двухфункционального хелатора в 75%-ной урожайности. Личность продукта была подтверждена с помощью протонной ЯМР, углерода ЯМР и MS с высоким разрешением. Сайт-селективной биосюджации PODS-DOTA к HER2-таргетинга антитела trastuzumab показано здесь.
Дисульфидные связи шарнирной области антитела были выборочно уменьшены, и антитела затем инкубировали с PODS-DOTA, чтобы позволить себе DOTA-несущий иммуноконъюгировать 80% урожайности. Анализ MALDI-TOF показал степень маркировки 1,8 DOTA на антитело. Который остается последовательным по всему спектру человеческих, гуманизированных и химерных антител IgG1.
Тем не менее, те же условия производят иммуноконъюгации со степенью маркировки 1,5 для murine IgG1 антител. Из-за светочувствительность этого соединения, важно, чтобы сохранить все реакции в фольге покрытые сосуды. Это увеличит общую урожайность продукта.
Хотя этот протокол описывает синтез PODS-DOTA, аналогичная процедура может быть применена к широкому кругу потенциальных грузов, включая фторфоры, токсины и другие хелаторы. Этот метод облегчит строительство четко определенных, однородных и высококонституальных иммуноконъюгированных препаратов, которые могут быть использованы в самых различных областях. Важно помнить, что идометан добавил в шаге один из этого эксперимента может иметь вредные последствия, и поэтому должны быть использованы в дым капот.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается синтез и применение PODS — нового реагента для сайт-специфической биоконъюгации белков и пептидов. Этот метод позволяет осуществлять простой синтез реагента практически в любой лаборатории.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биоконъюгация
- Химия белков
- Модификация антител
Теоретическая справка
- PODS представляет собой реагент на основе феноксидиазолилметилсульфона.
- Он обеспечивает сайт-селективное присоединение молекул к тиольным группам биомолекул.
- Данная технология является усовершенствованной версией традиционных биоконъюгаций на основе малеимид-тиольных взаимодействий.
- Значительным преимуществом является простота процесса синтеза.
Цель исследования
- Представить протокол синтеза PODS.
- Продемонстрировать применение данного метода в биоконъюгации.
- Охарактеризовать бифункциональный хелатор, содержащий PODS.
Используемые методы
- Растворение аминофенилоксадиазолтиола в метаноле.
- Добавление диизопропилетиламина в раствор.
- Использование магнитной мешалки для перемешивания.
- Характеристика синтезированного PODS и его конъюгация с модельными антителами.
Основные результаты
- PODS был успешно синтезирован в лабораторных условиях.
- Реагент продемонстрировал эффективную сайт-специфическую биоконъюгацию.
- Была проведена характеристика бифункционального хелатора, содержащего PODS.
- Метод показал преимущества по сравнению с традиционными методами биоконъюгации.
Выводы
- PODS предлагает простой и эффективный метод биоконъюгации.
- Этот реагент может быть синтезирован в различных лабораторных условиях.
- Данный протокол повышает эффективность присоединения грузов к биомолекулам.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Сайт-селективная биоконъюгация антител остается критической проблемой в разработке радиофармацевтических препаратов из-за нестабильности связей на основе малеимида in vivo. Химия на основе PODS позволяет создавать гомогенные стабильные иммуноконъюгаты с улучшенным удержанием в мишени и сниженным нецелевым накоплением. Это достижение способствует снижению предоклинических рисков при разработке конъюгатов антитело-лекарство и радиоактивно меченных терапевтических средств за счет повышения целостности полезной нагрузки и терапевтического индекса.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет исследовать взаимосвязь между структурой и функцией антител посредством сайт-специфичного присоединения терапевтического агента.
- Практическая ценность: Снижает неоднородность популяций конъюгатов, что упрощает их последующую характеристику.
- Прогностическая ценность: Повышает достоверность оценок доклинической эффективности и безопасности за счет минимизации вариативности загрузки препарата.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: позволяет получать четко определенные иммуноконъюгаты, подходящие для анализов связывания и интернализации.
- Воспроизводимость: стабильная степень мечения (~1,8 DOTA на антитело) для подклассов IgG1 способствует стандартизации анализа.
- Масштабируемость: надежный синтез в стандартных лабораторных условиях обеспечивает передачу технологии между исследовательскими группами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для исследования заболевания: Продемонстрирована более высокая эффективность in vivo на моделях колоректального рака у мышей по сравнению с малеимидными контролями.
- Трансляционная преемственность: Сайт-специфическая конъюгация сохраняет иммунореактивность, что способствует проведению исследований по взаимодействию с мишенью.
- Снижение рисков: Уменьшение обмена полезной нагрузкой и деградации по механизму ретро-Михаэля снижает риск нецелевой токсичности при оптимизации ведущих соединений.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Химия PODS является частью континуума от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая надежное создание стабильных иммуноконъюгатов для идентификации ведущих соединений и проведения исследований, необходимых для подачи заявки на регистрацию нового лекарственного препарата (IND).
- Биологические исследования: Поддержка проверки гипотез с помощью определенных конъюгатов антител для валидации мишени и изучения механизмов действия.
- Скрининг: Получение гомогенных конъюгатов для высокопроизводительного скрининга эффективности и селективности полезной нагрузки.
- Аналитика: Обеспечение точного количественного определения соотношения лекарственного средства к антителу с помощью MALDI-TOF и ЯМР для контроля однородности серий.
- Трансляционные исследования: Облегчение моделирования PK/PD за счет использования стабильных конъюгатов, устойчивых к тиольному обмену in vivo.
- Корпоративное повторное использование: Модульный дизайн реагентов позволяет адаптировать их под различные грузы (хелаторы, флуорофоры, токсины) в рамках нескольких проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Улучшенная валидация мишени за счет стабильной сайт-специфической сшивки, снижающей механистическую неоднозначность.
- Операционная ценность: Высокопродуктивный, воспроизводимый синтез (98% для PODS, 80% для конъюгации) минимизирует риск брака партий.
- Стратегическая ценность: Улучшенный терапевтический индекс и контрастность визуализации обеспечивают более обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) в рамках доклинических портфелей.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию конъюгатов с оптимальными фармакокинетическими профилями с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области органического синтеза и химии биоконъюгации.
- Необходимо стандартное лабораторное оборудование: круглодонные колбы, роторный испаритель, делительная воронка и вытяжной шкаф для работы с йодметаном.
- Необходима межгрупповая стандартизация протоколов конъюгации и аналитической характеристики (ЯМР, МС, MALDI-TOF).
- Адаптация для антител, отличных от IgG1, может потребовать оптимизации из-за различий в эффективности мечения (например, 1,5 DOTA для мышиного IgG1).
- Светочувствительность требует использования сосудов, обернутых фольгой, во время хранения и на этапах реакции для сохранения выхода и чистоты продукта.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:28
Synthesis of 4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-aniline (1)
1:15
Synthesis of Tert-butyl[18-({4-[5-(methylthio)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamate (2)
3:00
Synthesis of Tert-butyl[18-({4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl]phenyl}amino)-15,18-dioxo-4,7,10-trioxa-14-azaoctadecyl] Carbamate (3)
3:55
Synthesis of N1-(3-{2-[2-(3-aminopropoxy)ethoxy]-ethoxy}propyl)-N4-{4-[5-(methylsulfonyl)-1,3,4-oxadiazol-2-yl] phenyl}Succinamide (PODS)
4:47
Synthesis of PODS-DOTA and Bioconjugation of PODS-DOTA to Trastuzumab
6:05
Results: Synthesis of PODS and PODS-DOTA and Conjugation to Trastuzumab
8:01
Conclusion
