Мозг человека кровь интерфейс модель для изучения пересечения барьера патогенов или лекарства и их взаимодействия с мозгом
9 апреля 2019 г.
Здесь мы представляем протокол, описывающие настройку в cellulo BBB (гематоэнцефалический барьер)-Minibrain полиэстер пористые мембраны культуры вставить системы для того чтобы оценить перевозки биомолекул или инфекционных агентов через человека BBB и их физиологическое влияние на соседние клетки головного мозга.
Эта модель интерфейса крови и мозга человека полезна для изучения переноса молекул в нейро систему. А также для изучения микробов достигают инфицированной опухоли головного мозга. Добавление мини-мозга к этому гемовому мозгу или BBB модели позволяет изучать наши патогены и молекулы, которые вызывают BBB ведут себя в головном мозге.
Demostrating процедуры будет Флориан Бакао, аспирантов для моей лаборатории. Чтобы создать BBB мини-мозг полиэстер мембраны культуры вставки устройства, разбавить клетки в пять раз 10 до четвертой клетки на вставить концентрации неполной эндотелиальной клеточной среды и добавить соответствующий объем клеток для каждого полиэстер мембраны культуры вставить в 12 хорошо пластины. Затем поместите вставки и инкубатор культуры клеток до тех пор, пока клетки не достигнут 100%-го слияния.
Держите 12 хорошо пластины с одним миллилитр поли-D-лизин ее хорошо в течение четырех часов при комнатной температуре. Затем один миллилитр ламинина на колодец за ночь. Замените ламинин одним миллилитром эндотелиальной клеточной среды, дополненной сывороткой из крупного рогатого скота 5%, или FBS.
Поместите место в инкубатор на один час. Для приготовления мини-зерна аккуратно попробуйте опробовать астроциты человеческих нейронов в клоне CHME пяти клеток. Свяжут клеточные гранулы с полной эндотелиальной клеточной средой.
После подсчета в 3,6 раза от 10 до пятого нейронов и астроцитов в 0,4 раза от 10 до пятого клона CHME пять клеток на хорошо имеют 12 пластины хорошо. И семя 12 хорошо пластины. Чтобы построить BBB мини-мозг через 24 часа после посева заменить используемую среду со свежей полной эндотелиальной клеточной среды и передачи мозговой микро-сосудистой эндотелиальной клетки покрытием полиэфирной мембраны культуры вставки над мини-клеток мозга.
Затем поместите устройство BBB много мозга в инкубатор. Для проверки BBB мини мозга эндотелиальной проницаемости добавить 1,5 миллилитров транспортного буфера на колодец к новой пластине 12 хорошо. И переверните каждый фильтр вверх дном, чтобы тщательно удалить среду, не влияя на эндотелиальный клеточный барьер.
Поместите каждый фильтр в один колодец заполненной транспортной буферной пластины и добавьте в каждую колодец 0,5 миллилитров люцифера желтого цвета. Затем поместите пластину в инкубатор в течение 10 минут, прежде чем передать фильтры в новый транспортный буфер заполнены 12 пластины хорошо. После настройки BBB многие устройства мозга, как попродемонстрировано, добавить 3500 платформер единиц французского нейротрофического штамма вируса желтой лихорадки разбавленной и 50 микролитров 2%FPS эндотелиальной клеточной среды, очень тщательно, на вершине luminal отсека.
Прививать контроль BBB мини-мозг с 50 микролитров 2%FBS эндотелиальной клеточной среды без вируса. Затем поместите вирус подвергать BBB многие устройства мозга в инкубаторе в течение 24 часов. На следующий день удалите вставки, чтобы определить проницаемость эндотелиальной клетки и компаньона, а также так же, как это было продемонстрировано.
Сохранить один миллилитр образца из каждой хорошо, чтобы определить вирус titer в среднем отсеке. Под вставкой аккуратно, чтобы избежать утечки светимого отсека в аблюминальные отсеки. Для изучения транспортировки нейрона, нацеленного на биомолекуляр через геммоэнкефалический барьер, добавьте биомолекуляр, представляющий интерес для вставок, и верните пластину в инкубатор клеточной культуры.
Через 24 часа удаленно вставляется и определяется эндотелиальная проницаемость. Затем испачкать многие клетки мозга с соответствующим антителом для обнаружения присутствия био молекулы интереса в мини-мозг. Человеческие церебральные микрокосмочные эндотелиальные клетки выражают все подмножества рецепторов, транспортеров Efflux или транспортеров, которые являются ключевыми релевантными белками для их биологических функций.
Некоторые французские нейротропные штамм вируса желтой лихорадки может пересечь геммоградный барьер в 24 часов. Затем вирусы усиливаются в течение следующих двух дней путем умножения вируса внутри клеток мозга. Кроме того, экспрессия специфических вирусных биомаркеров стимулируется, когда эта нейроинвазивная вирусная популяция последовательно проносится на мини-клетки мозга и строго коррелирует с вирусной нагрузкой.
После добавления к пределу отсека клеток проникающая молекула Neuro-Tag Neurovita пересекает геммоуфический барьер и способна нацелиться на человеческие нейроны. Клеточная проникающая молекула нейро тега Delta neurovita пересекает эндотелиальный клеточный барьер, но нацелена менее эффективно на человеческие нейроны. После добавления в небольшой средний отсек, клеточная проникающая молекула Neuro-Tag Neurovita пересекает геммоугический барьер и способна регенерировать аксоны человеческих нейронов, после ранения.
В отличие от клеточной проникающей молекулы Neuro-Tag Neurovita Delta, неактивная форма Нейровита. При применении после аксон царапин клетки проникающей молекулы Neuro-Tag Neurovita вызывает нейрозащиту раненых нейронов и х зональной регенерации. Строго ради практики.
не более использовать I-клетки проходы. Постарайтесь сохранить некоторое подобие среды и регионов и проверить на отсутствие микоплазмы. Взаимодействия между мини-мозгом и препаратами являются микробами, представляющими интерес, могут быть дополнительно изучены с помощью стенограммы, которая химически оцифровывазирует эту или классическую биологию, называемую методами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описывается создание мини-модели человеческого гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) с использованием культуральных вставок с пористой полиэфирной мембраной для исследования транспорта биомолекул и инфекционных агентов в центральную нервную систему. Целью исследования является оценка физиологического воздействия на соседние клетки мозга, что позволяет получить представление о взаимодействиях между ГЭБ и различными патогенами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Клеточная биология
- Инфекционные заболевания
Теоретические основы
- Гематоэнцефалический барьер имеет жизненно важное значение для защиты мозга, в то же время создавая определенные трудности для доставки лекарственных препаратов и проникновения патогенов.
- Модель «мини-мозга» облегчает взаимодействие между нейронами человека и ГЭБ.
- Данный подход позволяет оценивать проницаемость и физиологическое воздействие различных молекул.
Цель исследования
- Для оценки транспорта биомолекул и вирусов через ГЭБ.
- Для изучения воздействия патогенов на нейрональные клетки.
- Для разработки надежной модели для последующего тестирования лекарственных препаратов и нейробиологических исследований.
Используемые методы
- В исследовании использовалась система клеточных культур с полиэфирными мембранными вставками в 12-луночном планшете.
- Биологическая модель включала эндотелиальные клетки микрососудов головного мозга человека в сочетании с нейронами и астроцитами человека.
- Критически важные этапы включали культивирование клеток до достижения конфлюэнтности, воздействие вирусных агентов и измерение проницаемости эндотелия.
- Систему инкубировали, а через определенные интервалы времени проводили различные анализы для оценки результатов.
Основные результаты
- Исследование подтвердило, что некоторые вирусы способны преодолевать ГЭБ и размножаться в клетках мозга.
- Молекулы, проникающие в клетки, продемонстрировали способность восстанавливать аксоны и обеспечивать нейропротекцию.
- Эксперименты по валидации показали прямую корреляцию между вирусной нагрузкой и экспрессией специфических биомаркеров.
Выводы
- Данное исследование позволяет углубить понимание динамики ГЭБ и его взаимодействия с патогенами.
- Полученные результаты способствуют разработке терапевтических стратегий, направленных на нейроваскулярный интерфейс.
- Результаты имеют значение для разработки потенциальных методов лечения заболеваний, поражающих головной мозг.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Модель BBB-Minibrain восполняет критический пробел в разработке нейротерапевтических средств на ранних стадиях, позволяя проводить прогностическую оценку проницаемости гематоэнцефалического барьера и взаимодействия с мишенью. Эта релевантная для человека система in cellulo поддерживает механистическое снижение рисков при отборе кандидатов в лекарственные препараты и изучении патогенов перед тестированием in vivo, что соответствует приоритетам отрасли по повышению трансляционной достоверности и сокращению использования животных. Ее совместимость со стандартными рабочими процессами культивирования клеток облегчает интеграцию в конвейеры поиска новых лекарств для валидации мишеней и разработки анализов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, касающиеся доставки лекарств в ЦНС и взаимодействий между патогенами и мозгом.
- Операционная ценность: предоставляет воспроизводимую систему на основе человеческих клеток для оценки специфичности мишеней и механизмов барьерного транспорта.
- Прогностическая ценность: помогает принимать ранние решения о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), коррелируя преодоление барьера с функциональными результатами в нейронах, такими как нейропротекция или аксональная регенерация.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные о молекулярном транспорте через барьер и последующих клеточных эффектах в компартменте с мини-мозгом.
- Практическая ценность: использование стандартизированных вкладышей и четко определенных тестов на проницаемость (например, с использованием Lucifer yellow) обеспечивает согласованность и масштабируемость анализа.
- Готовность к скринингу: совместимость с форматами высококонтентного скрининга для оценки библиотек нейроактивных соединений или вирусных частиц.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Сохраняет фенотипическую релевантность нейронов, астроцитов и микроглиальных клеток человека, обеспечивая получение показателей нейроинвазии или нейропротекции, соответствующих биомаркерам.
- Снижение механистических рисков: Позволяет наблюдать амплификацию патогена и экспрессию биомаркеров после преодоления барьера, что необходимо для оценки кандидатов в противовирусные или нейропротекторные препараты.
- Релевантная заболеванию система: Моделирует взаимодействия нейроваскулярного модуля, применимые в контексте нейродегенеративных, инфекционных и нейровоспалительных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Система BBB-Minibrain вписывается в континуум ранних этапов разработки лекарств, в частности, после идентификации мишени и до оптимизации ведущего соединения, предоставляя релевантную для человека платформу для оценки проникновения препарата в мозг и модуляции мишени.
- Открывательная биология: Обеспечивает проверку гипотез о механизмах барьерного транспорта и последующем воздействии препаратов или патогенов на нейроны.
- Скрининг: Позволяет проводить стандартизированную оценку проникновения соединений или вирусов с количественным определением конечных показателей в клетках мозга.
- Аналитика: Предоставляет измеримые результаты, включая эндотелиальную проницаемость, внутриклеточное накопление и фенотипические изменения в нейронах (например, регенерацию нейритов, экспрессию маркеров).
- Трансляционные исследования: Связывают данные о проницаемости с функциональными ответами клеток мозга, что способствует согласованию биомаркеров и подтверждению механизмов действия.
- Корпоративное повторное использование: Разработано для многократного применения в различных проектах с помощью стандартизированных методов культивирования клеток и криоконсервированных клеточных линий, что снижает нагрузку по ревалидации.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность прогнозов доставки лекарств в ЦНС и их взаимодействия с мишенью за счет моделирования взаимодействий между барьером и мозгом человека.
- Практическая ценность: Используются доступные методы культивирования клеток и стандартное лабораторное оборудование, что сводит к минимуму необходимость в специализированном обучении.
- Стратегическая ценность: Снижает зависимость от животных моделей при первичном скрининге проницаемости ГЭБ, что улучшает соблюдение этических норм и увеличивает пропускную способность исследований.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию кандидатов с учетом рисков на основе подтвержденной доставки в мозг и специфической активности в отношении мишени.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток человека, включая поддержание эндотелиальных, нейрональных клеток, астроцитов и микроглии.
- Метод основан на использовании вставок с пористой полиэстерной мембраной и стандартных 12-луночных планшетов, совместимых с инкубаторами и системами визуализации.
- Необходима стандартизация плотности посева клеток, составов сред и времени проведения анализа проницаемости между исследовательскими группами.
- Адаптация к альтернативным моделям заболеваний может потребовать подтверждения стабильности фенотипа клеток и целостности барьера при длительном культивировании.
- Практические ограничения включают возможную вариабельность источников первичных клеток и необходимость регулярного тестирования на микоплазму для обеспечения достоверности данных.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Title
0:36
Human Cerebral Microvascular Endothelial Cell (hCMEC)/D3 Insert Coating and Blood Brain Barrier (BBB) Preparation
2:48
BBB-Minibrain Endothelial Permeability Validation
3:38
BBB Crossing and Multiplication of Yellow Fever Viruses in the Minibrain and Biomolecule BBB Crossing and Brain Cell Targeting
5:22
Results: Representative BBB-Minibrain Testing of Neuroinvasive Variants and Biomolecule Properties
7:19
Conclusion
