Быстрая оценка токсичности химических соединений с использованием эмбрионов зебры
25 августа 2019 г.
Эмбрионы зебры используются для оценки токсичности химических соединений. Они развиваются внешне и чувствительны к химическим веществам, что позволяет обнаруживать тонкие фенотипические изменения. Эксперимент требует лишь небольшого количества соединения, которое непосредственно добавляется в пластину, содержащую эмбрионы, что делает систему тестирования эффективной и рентабельной.
Процедуры тестирования токсичности продемонстрируют доктор Ашок Аспатвар, старший научный сотрудник моей лаборатории. Наш протокол определяет внецелетворные эффекты и обнаруживает тонкие токсичные эффекты химических веществ на ранней стадии открытия, которые могут быть пропущены в клеточной культуре или других животных моделях. Основные преимущества нашей техники: она быстрая и эффективная, требует очень небольшого количества химических веществ, а также основных объектов в лаборатории.
Скрининг токсичности поможет нам определить концентрацию для изучения его эффективности против микобактерий, который вызывает туберкулез и для дальнейшего доклинциозного расчета. Этот метод использует понимание внецелегового воздействия химических веществ, и, следовательно, этот метод может быть использован в любой области исследований, где токсичность химических имеет первостепенное значение. Этот метод очень прост и может быть осуществлен кем угодно без предварительного опыта.
Лица, не имеют опыта должны планировать эксперимент тщательно и использовать только одно соединение. Этот метод обеспечивает токсическое воздействие химических веществ в виде фенотипических изменений в развивающихся эмбрионах зебры и, следовательно, безопасность проверенных соединений. Для начала поместите от двух до пяти взрослых самцов зебры и от трех до пяти взрослых самок зебры в брачные резервуары на ночь.
Утром включите свет, так как разведение вызвано автоматическим темным и последующим световым циклом. Чтобы избежать стресса для животных, позвольте животным отдохнуть в течение двух недель, прежде чем использовать те же лица для разведения. На следующий день до полудня, собирать эмбрионы с помощью тонкой сетки ситечко, и передать их на чашку Петри, содержащий E3 эмбриона среды.
Поместите чашку Петри под стерео микроскоп для изучения каждой партии эмбрионов. Определите непрозрачный внешний вид и удалите их как неутилизованные или мертвые эмбрионы. Держите эмбрионы на уровне 28,5 градусов по Цельсию в инкубаторе на ночь.
На следующее утро осмотрим эмбрионы под стерео микроскопом и удалите нездоровые или мертвые эмбрионы. Тщательно используйте пастер пипетку для передачи одного эмбриона в каждый колодец из 24 пластины хорошо. Убедитесь, что каждый хорошо содержит достаточно E3 среды для покрытия эмбрионов.
Вынюхив флаконы, содержащие ингибирующие соединения, хранящиеся при 4 градусах по Цельсию в холодильнике. Используйте аналитический баланс, чтобы взвесить соответствующее количество соединения, и подготовить 250 микролитров 100 миллимолярный раствор для каждого соединения в E3 среднего или другого соответствующего растворителя. Затем используйте E3 medium для серийного разбавления фондовых растворов на основе уровней токсичности в 15 миллилитровых центрифугах.
Из колодцев, каждый из которых содержит один эмбрион DPF, используйте пастерную пипетку и 1 миллилитровую пипетку для удаления воды E3 по одному ряду за раз. Немедленно распределите 1 миллилитр каждого разбомбительного раствора штока в скважины плиты 24 скважин, начиная с нижней и переходя к более высокой концентрации. Для контрольных групп добавьте воду E3 или другой соответствующий растворитель.
Этикетка 24 хорошо пластин с названием и концентрацией соединения и держать пластины на 28,5 градусов по Цельсию в инкубаторе. Позаботьтесь о том, чтобы разбавляющие вещества в скважинах не испарялись в инкубаторе путем уплотнения сторон 24 пластины скважины. Двадцать четыре часа после воздействия химических соединений, использовать пастер пипетки для передачи личинок подвергаются каждой концентрации соединения в небольшой чашке Петри, содержащей 3%высокий молекулярный вес метил-целлюлозы.
С металлическим зондом, положите его боком. Поместите чашку Петри под стерео микроскоп, прикрепленный к камере. Возьмите изображения и сохраните изображения в отдельной папке каждый день до конца эксперимента.
Введите все наблюдения в таблице каждый день либо в онлайн-таблице, либо на печатном листе. Для нейротоксического воздействия соединения, от четырех до пяти личинок DPF может показать ненормальный характер плавания. В этом случае, сделать запись таких изменений, захватив короткие 30 секунд до одной минуты видео личинок.
После пяти дней воздействия химических соединений, обратите внимание на концентрацию, при которой половина эмбрионов умирают, как половина максимальной смертельной концентрации 50 каждого химического вещества. Создайте кривую смертности эмбрионов для всех концентраций с помощью подходящей программы. В этом протоколе важной частью оценки токсичности является тестирование различных концентраций одного или нескольких химических соединений в одном эксперименте.
Для соединений, которые вызывают любые фенотипические дефекты в личинках, дефекты были зарегистрированы каждые 24 часа в течение одного-пяти дней после воздействия химического вещества. Эмбрионы, обработанные ингибиторами бета-CA в концентрациях 250 микромоляров и 125 микромоляров, обладают различными фенотипическими дефектами по сравнению с контролем. Например, неохотные эмбрионы даже на 3-й день, изогнутая структура тела, непритязаемый желточный мешок и перикардиальный отек, а также отсутствие отолитовых мешков в личинках через пять дней после лечения.
В другом исследовании эмбрионы, обработанные ингибиторами CA, показали отсутствие отолитных мешков и плавательного пузыря. Эксперименты выявили репрезентативное соединение углеродной ангидразы 9, которое индуцировало минимальные или нет фенотипических изменений во время эмбрионального развития на уровне 500 микромолей. Соединение показало высокую концентрацию LC50.
Однако, по сравнению с контролем, то же соединение на 300 микромоляров было установлено, что нейротоксические и индуцированной атаксии в личинках после пяти дней воздействия. Хорошее качество эмбрионов имеет важное значение для скрининга токсичности химических веществ. Для получения эмбрионов хорошего качества используйте молодую пару взрослых зебр для размножения.
Соединения, которые возникают как безопасные могут быть дополнительно охарактеризованы путем выполнения соответствующих in vitro и in vivo экспериментов. В области разработки антитуберкулезных препаратов, этот метод помог создать дальнейшие эксперименты для инвиво ингибирования микобактерий маринума в эмбрионах зебры. Протокол включает в себя использование химических веществ, которые могут быть токсичными для человека.
Лица, участвующие в экспериментах, должны должным образом заботиться при обращении с химическими веществами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эмбрионы zebrafish используются для тестирования химических соединений на токсичность благодаря их внешнему развитию и чувствительности к химическим веществам. Данный метод позволяет выявлять незначительные фенотипические изменения при минимальном расходе соединений, что делает его эффективной и экономически выгодной системой тестирования.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Токсикология
- Нейробиология
- Фармакология
Теоретические основы
- Эмбрионы zebrafish идеально подходят для оценки химической токсичности.
- Они развиваются внешне, что обеспечивает четкий обзор фенотипических изменений.
- Небольшие количества химических веществ можно тестировать непосредственно на эмбрионах.
- Этот подход позволяет выявить побочные эффекты, которые часто упускаются в других моделях.
Цель исследования
- Продемонстрировать быстрый и эффективный протокол тестирования токсичности.
- Выявить слабые токсические эффекты химических веществ на ранних этапах поиска.
- Помочь в определении концентраций для дальнейших исследований против патогенов.
Используемые методы
- Прямое нанесение химических соединений на эмбрионы zebrafish.
- Наблюдение за фенотипическими изменениями для оценки токсичности.
- Использование базового лабораторного оборудования для тестирования.
- Скрининг побочных эффектов химических веществ.
Основные результаты
- Метод прост в исполнении и может быть реализован без предварительного опыта.
- Он позволяет эффективно выявлять побочные эффекты химических веществ.
- Быстрое получение результатов способствует оперативному принятию решений о проведении дальнейших исследований.
- Метод применим в различных областях исследований, где критически важна химическая токсичность.
Выводы
- Эмбрионы zebrafish представляют собой ценную модель для тестирования токсичности.
- Данный метод повышает эффективность оценки химических веществ на ранних стадиях.
- Метод может быть адаптирован для различных целей исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Скрининг эмбрионов zebrafish на токсичность позволяет на ранних этапах обнаруживать побочные и слабовыраженные токсические эффекты при разработке лекарственных препаратов, что снижает вероятность отсева кандидатов на поздних стадиях. Данный метод обеспечивает быструю оценку соединений при использовании малых объемов, повышая эффективность использования капитала и прогностическую точность при выборе ведущих соединений. Он особенно ценен для приоритизации соединений в программах разработки противотуберкулезных и других препаратов, направленных против патогенов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы, выявляя фенотипические дефекты, связанные с воздействием соединения.
- Операционная ценность: требует всего 3-6 mg соединения, что делает возможным скрининг ценных молекул или молекул, имеющихся в ограниченном количестве.
- Прогностическая ценность: позволяет обнаружить нейротоксичность и токсичность для развития, которые не выявляются в культурах клеток, что способствует снижению рисков при выборе мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные LC50 и фенотипические показатели с временным разрешением для моделирования зависимости «доза-эффект».
- Практическая ценность: использует стандартную стереомикроскопию и инфраструктуру инкубатора, не требуя специализированного оборудования.
- Масштабируемость: позволяет тестировать несколько концентраций в одном 24-луночном планшете, что обеспечивает возможность проведения скрининговых кампаний со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: Связь ранних данных о токсичности с последующей валидацией in vivo, например, в исследованиях по ингибированию mycobacterium marinum.
- Механистическое снижение рисков: Идентификация соединений с минимальным фенотипическим воздействием (например, карбоангидраза 9 при 500 µM) для дальнейшего изучения.
- Соответствие биомаркеров: Фенотипические конечные точки, такие как перикардиальный отек и наполнение плавательного пузыря, служат транслируемыми индикаторами токсичности.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод применим на этапе ранних этапов поиска для оптимизации ведущих соединений и выбора доклинических кандидатов, особенно в условиях ограниченного количества доступных соединений.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы о фенотипах развития и нейротоксичности, индуцированных соединениями.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимую оценку смертности и сублетальных дефектов в период от 1 до 5 дней после оплодотворения.
- Аналитика: предоставляет расчеты LC50 и временные профили дефектов для сравнительного ранжирования соединений.
- Трансляционные исследования: поддерживают преемственность от моделей эмбриональной токсичности к моделям ингибирования патогенов в целом организме.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный, малозатратный контрольный этап оценки токсичности, применимый в различных терапевтических областях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет регистрации профилей токсичности всего организма.
- Операционная ценность: Время одного цикла составляет 8-10 часов, что позволяет проводить быстрые итерации на этапах перехода от поиска хитов к оптимизации лидов.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») за счет раннего выявления неприемлемой токсичности, что снижает биологические риски в портфелях.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации с учетом рисков, направляя ресурсы на соединения с более благоприятными профилями безопасности.
Особенности реализации
- Требуются базовые навыки содержания zebrafish и работы с эмбрионами.
- Необходимы стереомикроскоп, инкубатор с температурой 28,5°C и стандартная лабораторная посуда (24-луночные планшеты, пипетки Пастера).
- Требуется последовательное определение стадии развития эмбрионов и «слепой» метод оценки для обеспечения надежности данных разными пользователями.
- При подготовке серий разведений необходимо учитывать растворимость соединений и использовать контроли с растворителем.
- Метод ограничен оценкой острой токсичности; для изучения хронических или органоспецифических эффектов требуются дополнительные модели.
